一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法技术

本发明专利技术公开一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法。该方法采用二氧化钛柱分离技术实现了血清中复杂鞘脂组学的样品制备步骤，包括中性鞘脂与酸性鞘脂的分离，酸性鞘脂与糖鞘脂的分离。本发明专利技术能将中性鞘脂、糖鞘脂和酸性鞘脂(如磷酸化鞘脂和硫苷脂)分离，因此在质谱中实现了去除高丰度中性鞘脂对其它微量甚至痕量鞘脂(糖鞘脂和磷酸化鞘脂)的定性及定量。本发明专利技术的二氧化钛富集法，从临床标本中检测出8个生物标志物，其中包括中性鞘脂中的神经酰胺、酸性鞘脂中的S1P和C1P、以及糖鞘脂。而这8个生物标志物，可以将早期和中晚期病人很好的区分。

A specific method for separation and enrichment of acidic sphingolipids and glycosphingolipids in human serum

【技术实现步骤摘要】
一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法
本专利技术涉及生物样品分离领域，特别涉及一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法。
技术介绍
肺癌是世界上癌症死亡的主要原因，其发病率呈逐年上升趋势，其病死率在各类肿瘤中居首位。但由于其早期病变缺乏明显、特异的临床表现，难于发现，大多数患者就诊时已是中晚期，延误了最佳治疗时机。由于不易取得病理组织，常延误诊治，这就对临床诊断肺癌的方法手段提出更高要求。肺癌主要有两种类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(1)。NSCLC占肺癌的80-85％且存活率非常低，所有阶段的5年总生存期(OS)仅为约15％(2)。因此，灵敏度高、专属性的NSCLC的临床标志物确定，对患者能及时接受干预并预防，对预防癌症进展至关重要(3)。鞘脂(Sphingolipid)是一类以鞘氨醇为骨架的复杂化合物，广泛存在细胞膜上。随着研究的深入，鞘脂与疾病之间的关联研究越来越多，其中包括各类肿瘤，代谢病，自身免疫病等(表1)。目前国内外对鞘脂类研究较多的是其在肿瘤发病机制及治疗中的应用，而在疾病的诊断方面的研究较少。近年来鞘脂组学可以与基因组或蛋白质组相媲美，甚至超过他们。调控肿瘤细胞生长及转移的活性鞘脂主要有神经酰胺(ceramide,Cer)、鞘氨醇(sphingosine,Sph)、鞘氨醇-1-磷脂(sphingosine-1-phosphate,S1P)、神经酰胺-1-磷脂(ceramide-1-phosphate,C1P)以及糖鞘脂(glycosphingolipids,GSLs)，它们构成了一个重要的代谢平衡体，被称为鞘脂变阻器(Cer-sph-S1P)。其中Cer和Sph具有抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用；而S1P、C1P和GSLs则具有促进细胞增殖、分化的作用(4)。上调的S1P与其受体S1PR1(是具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体)形成S1P-S1PR1轴可促进癌细胞增殖，迁移和侵袭；并在调节淋巴细胞成熟，迁移和运输方面具有重要作用(5)。表1.在癌症中差异表达或产生的鞘脂酶和鞘酯代谢物近年来，鞘脂代谢在耐药产生中的作用逐渐被重视，前期研究表明Cer转化为S1P后可介导各种癌症进展(12)(13)。从癌症基因组图谱(TCGA)、基因表达综合数据库(GEO)和Oncomine三种在线数据库的统计结果发现：S1P，C1P，sulfatide和糖鞘脂合成酶SPHK1，CERK和UGCG在非小细胞肺癌患者中特异性高表达。Kaplan-Meier生存分析表明：SPHK1的高表达与肺癌患者的预后不良正相关。但是：由于磷酸化鞘脂类成分S1P，C1P的磷酸化修饰在质谱中的低电离效率和源内裂解，以及糖鞘脂的结构多样性及在体液中的低丰度，导致磷酸化、硫酸化和糖鞘脂的分析在鞘脂组学研究中是一项巨大挑战。为解决这些特殊修饰鞘脂类检测困难的这个技术挑战，我们开发了一种方法来全面提高这些鞘脂的检测灵敏度，即选用二氧化钛(TiO2)技术来特异性富集酸性鞘脂和糖鞘脂。参考文献：1.TorreLA,FreddieB,SiegelRL,JacquesF,JoannieLT,AhmedinJ.Globalcancerstatistics,2012.CaACancerJournalforClinicians.2015；65(2):87-108.2.LiuJ,YangX,ShiW.Identifyingdifferentiallyexpressedgenesandpathwaysintwotypesofnon-smallcelllungcancer:Adenocarcinomaandsquamouscellcarcinoma.GenetMolRes.2014；13:95-102.3.Galvan-FemeniaI,GuindoM,DuranX,Calabuig-FarinasS,MercaderJM,RamirezJL,etal.Genomicprofilinginadvancedstagenon-small-celllungcancerpatientswithplatinum-basedchemotherapyidentifiesgermlinevariantswithprognosticvalueinSMYD2.Cancertreatmentandresearchcommunications.2018；15:21-31.4.OgretmenB.Sphingolipidmetabolismincancersignallingandtherapy.NaturereviewsCancer.2018；18(1):33-50.5.MaceykaM,SpiegelS.Sphingolipidmetabolitesininflammatorydisease.Nature.2014；510(7503):58.6.MaitiA,TakabeK,HaitNC.Metastatictriple-negativebreastcancerisdependentonSphKs/S1Psignalingforgrowthandsurvival.Cellularsignalling.2017；32:85-92.7.AndersenLD,OrntoftTF,SorgeJA,NovoradovskyA.ExpressionLevelsofCOL4A3BPandotherMarkersCorrelatingwithProgressionorNon-ProgressionofBladderCancer.GooglePatents；2013.8.SuchanskiJ,GrzegrzolkaJ,OwczarekT,PasikowskiP,PiotrowskaA,KocbachB,etal.Sulfatidedecreasestheresistancetostress-inducedapoptosisandincreasesP-selectin-mediatedadhesion:atwo-edgedswordinbreastcancerprogression.BreastCancerResearch.2018；20(1):133.9.GrammatikosG,SchoellN,FerreirósN,BonD,HerrmannE,FarnikH,etal.SerumsphingolipidomicanalysesrevealanupregulationofC16-ceramideandsphingosine-1-phosphateinhepatocellularcarcinoma.Oncotarget.2016；7(14):18095-105.10.CheJ,HuangY,XuC,Zhang1P.Increasedceramideproductionsensitizesbreastcancercellresponsetochemotherapy.CancerChemotherPharmacol.2017.11.PetracheI,BerdyshevEV.CeramideSignalingandMetabolisminPathop本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取人血清，加入甲醇和氯仿后，再加入C12‑硫苷酯溶液，超声波室温震荡，40～60℃温育过夜，进行第一次提取，获得提取液；其中，人血清、甲醇、氯仿、C12‑硫苷酯溶液的体积比为(3～5)：1000：(30～50)：1；(2)将提取液放冷至室温后加入氢氧化钾甲醇溶液并在37℃水浴振荡2小时；放冷至室温加乙酸中和；离心，取上清，获得上清A；其中，氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为0.5～1.5：1；(3)沉淀加入甲醇，氯仿和异丙醇超声震荡混匀后，离心，取上清，获得上清B；其中，甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为0.5～1：1～2：0.5～1；(4)沉淀加入氯仿和水，轻轻震荡分层后，离心，取下层，并与上清A和上清B合并，离心干燥，制得总脂类样品；其中，氯仿和水的体积比为1：1；(5)二氧化钛小柱：将二氧化钛粉末置于带有筛板，上下端具塞的、无填料的固相萃取小柱中，制得二氧化钛小柱；用上样缓冲液冲洗二氧化钛小柱6～8次；其中，上样缓冲液为0.6％乙酸，2％甲酸和2％乙腈溶液，pH为0.8～1.2；(6)上样：将步骤(4)制备的总脂类样品用样品溶解缓冲液超声溶解之后，离心；将溶解后的样品滴加入二氧化钛小柱中，上下颠倒混匀；轻度离心后收集洗脱液，离心干燥，获得中性鞘脂；其中，样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水＝6：3：0.5，pH为0.8～1.2；(7)糖鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅰ加入步骤(6)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，获得糖鞘脂；其中，洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸＝40～60：40～60：1，pH为2.8～3.2；(8)磷酸化和硫酸化鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅱ加入步骤(7)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，所得为磷酸化和硫酸化鞘脂类成分，即酸性鞘脂；其中，洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性10～11，混匀后加入乙腈：水：甲酸＝20～80：20～80：0.5；(9)对中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂分别进行超高效液相‑高分辨质谱分析。...

【技术特征摘要】
1.一种特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取人血清，加入甲醇和氯仿后，再加入C12-硫苷酯溶液，超声波室温震荡，40～60℃温育过夜，进行第一次提取，获得提取液；其中，人血清、甲醇、氯仿、C12-硫苷酯溶液的体积比为(3～5)：1000：(30～50)：1；(2)将提取液放冷至室温后加入氢氧化钾甲醇溶液并在37℃水浴振荡2小时；放冷至室温加乙酸中和；离心，取上清，获得上清A；其中，氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为0.5～1.5：1；(3)沉淀加入甲醇，氯仿和异丙醇超声震荡混匀后，离心，取上清，获得上清B；其中，甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为0.5～1：1～2：0.5～1；(4)沉淀加入氯仿和水，轻轻震荡分层后，离心，取下层，并与上清A和上清B合并，离心干燥，制得总脂类样品；其中，氯仿和水的体积比为1：1；(5)二氧化钛小柱：将二氧化钛粉末置于带有筛板，上下端具塞的、无填料的固相萃取小柱中，制得二氧化钛小柱；用上样缓冲液冲洗二氧化钛小柱6～8次；其中，上样缓冲液为0.6％乙酸，2％甲酸和2％乙腈溶液，pH为0.8～1.2；(6)上样：将步骤(4)制备的总脂类样品用样品溶解缓冲液超声溶解之后，离心；将溶解后的样品滴加入二氧化钛小柱中，上下颠倒混匀；轻度离心后收集洗脱液，离心干燥，获得中性鞘脂；其中，样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水＝6：3：0.5，pH为0.8～1.2；(7)糖鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅰ加入步骤(6)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，获得糖鞘脂；其中，洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸＝40～60：40～60：1，pH为2.8～3.2；(8)磷酸化和硫酸化鞘脂洗脱：将洗脱缓冲液Ⅱ加入步骤(7)洗脱后的二氧化钛小柱中，离心取洗脱液，重复2～3次；合并洗脱液并干燥，所得为磷酸化和硫酸化鞘脂类成分，即酸性鞘脂；其中，洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性10～11，混匀后加入乙腈：水：甲酸＝20～80：20～80：0.5；(9)对中性鞘脂、酸性鞘脂和糖鞘脂分别进行超高效液相-高分辨质谱分析。2.根据权利要求1所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：步骤(1)中，人血清、甲醇、氯仿、C12-硫苷酯溶液的体积比为5：1000：50：1；步骤(2)中所述的氢氧化钾甲醇溶液与人血清的体积比为1.5：1；步骤(3)中所述的甲醇，氯仿和异丙醇的体积比为1：2：1。3.根据权利要求1所述的特异分离富集人血清中酸性鞘脂及糖鞘脂的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的上样缓冲液为0.6％乙酸，2％甲酸和2％乙腈溶液，pH为1.0；步骤(6)中所述的样品溶解缓冲液为氯仿：甲醇：水＝6：3：0.5，pH为1.0；步骤(7)中所述的洗脱缓冲液Ⅰ为乙腈：水：甲酸＝60：40：1，pH为3.0；步骤(8)中所述的洗脱缓冲液Ⅱ为先加入氨水溶液调节pH为碱性11，混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟琼，黄炳培，赵新保，孟亚明，孔祥展，陈逸钿，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44