一种脂肪酶在拆分外消旋2-溴代异戊酸乙酯中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脂肪酶在拆分2‑溴代异戊酸乙酯中的应用，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组脂肪酶；该重组脂肪酶具有催化拆分外消旋2‑溴代异戊酸乙酯的能力，可以得到产物(R)‑2‑溴代异戊酸乙酯，对映体过量值>99％和转化率达到50.8％，产物(R)‑2‑溴代异戊酸乙酯的质量收率达到96.4％，而且拆分效率高。

Application of a Lipase in Resolution of Racemic Ethyl 2-Bromoisovalerate

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶在拆分外消旋2-溴代异戊酸乙酯中的应用(一)
本专利技术属于生物催化
，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解拆分2-溴代异戊酸乙酯对映体合成单一构型的(R)-2-溴代异戊酸乙酯对映体的应用。(二)
技术介绍
氟胺氰菊酯是非环丙烷梭酸类的拟除虫菊酯，具有和氰戊菊酯相似的结构。它共有四个光学异构体。工业品是由右旋酸和消旋氰醇组成的一对高效体，具有广谱的杀虫活性具触杀和胃毒作用，还有拒食和驱避活性。其毒力和氰戊菊酯相当能有效地防治棉花、果树、蔬菜、玉米、茶叶、烟草等作物上包括鳞翅目、鞘翅目、同翅目、和双翅目、在内的主要害虫。另外它还能防治牲畜害虫如血红扁头蜂、羊鼻蝇角蝇、厩蝇、狗栉头蚤等。文献中多数用原料D-缬氨酸来合成得到氟胺氰菊酯，D-缬氨酸法虽然可以直接得到手性产物，但价格比较昂贵。而从价格较为低廉的2-溴代异戊酸乙酯来合成氟胺氰菊酯的消旋体，再通过手性拆分来得到工业品应用的高效体，可以降低生产成本，提高经济效益。然而我们提供了一种脂肪酶来催化水解拆分2-溴代异戊酸乙酯来高效生产(R)-2-溴代异戊酸乙酯的有效方法，可以直接得到手性产物，从而大大降低了成本。脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(Triacylglycerolacylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦NovoNordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种立体选择性脂肪酶在生物法拆分2-溴代异戊酸乙酯中的应用，可以直接获得手性产物，大大降低成本。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种脂肪酶在拆分2-溴代异戊酸乙酯中的应用(如图1所示)，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因序列为SEQIDNO.2所示，脂肪酶基因源自米曲霉WZ007(AspergillusoryzaeWZ007)，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNo:M206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申请专利(中国专利CN101186938)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。本专利技术在此专利申请的基础上，进行目标脂肪酶和基因的挖掘。具体的应用方法为：从本米曲霉WZ007出发，提取mRNA经反转录得到cDNA，根据NCBI查得的米曲霉基因组GenBank:NWUI02000090.1碱基序列的基础上，设计上游引物为5'-CCATGGGCATGAAGATTCAAAAACTCATTCTGTACAGTCT-3'和下游引物为5'-CTCGAGTTAATATGCATACTTTGCAATGTCAGGC-3'，进行PCR，得到碱基基因序列SEQIDNO.2片段，测序验证正确，将该片段连接至载体pET-28b(+)，转化至Rosetta感受态，经发酵培养获得的湿菌体提取的粗酶为催化剂，以2-溴代异戊酸乙酯为底物，以pH7.0磷酸盐缓冲液为反应介质，在20-45℃、800-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得产物(R)-2-溴代异戊酸乙酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为15-30g/L(优选30g/L)，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-10g/L(优选6g/L)。进一步，优选反应时间为3-7h，更优选反应条件为35℃、1000rpm反应5h。进一步，所述缓冲液为pH7.0，0.2mM的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲溶液。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含脂肪酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌Rosetta)接种在LB培养基中，37℃培养OD600至0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到脂肪酶粗酶粉；LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。进一步，本专利技术所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液用4mMHCl进行酸化至pH2.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，干燥，旋蒸，得到产物(R)-2-溴代异戊酸乙酯。本专利技术脂肪酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：MKIQKLILYKFANELTASGLIPSKALTCLNGYAIIDLNSIHRHNPSPENLSIYPYKAKSDAPYSIAENTLRAGIHIPRSFSHKRDKKIPVLLVPGTAVPAAITFYFNFGKLRRALPESELVWIDLPQASLDDIQLSAEYVAYALNYVSALTSSKIAVISWSQGALDIQWALKYWPSTRGVVNDFIAISPDFHGTIVKWLVCPLLNDLACTPSIWQQGWDANFIQALRSQGGDSAYVPTTTIYSSFDKIVRPMSGENASARLLDYRGVGVSNNHLQTICANNAAGGLYTHEGVLYNPLAWALTVDALLHDGPSNITRIDTQKICEQVLPPYLELTDMLGTEALLLVALAKILTYSPKVSGEPDIAKYAY由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本专利技术所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪酶在拆分外消旋2‑溴代异戊酸乙酯中的应用，其特征在于所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶在拆分外消旋2-溴代异戊酸乙酯中的应用，其特征在于所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述脂肪酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冻干后的脂肪酶粗酶粉为生物催化剂，以外消旋2-溴代异戊酸乙酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在20-45℃、800-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-2-溴代异戊酸乙酯。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为15-30g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-10g/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于反应时间为3-7h。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建永，吴鹏，汪钊，章银军，张梦婕，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33