一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针及其应用制造技术

一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针，其结构式为：

A Near Infrared Emission Fluorescence Probe for Differentiating Cys from GSH/H2S and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针及其应用
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种区分Cys和GSH/H2S的荧光探针及其应用。
技术介绍
生物硫醇如硫化氢(H2S)和半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)都属于不可或缺的存在于生命系统的活性硫物种(RSS)，因为他们在人类各种各样的生理和病理过程中扮演重要的角色。例如：细胞内氧化应激的规则，信号的传输，以及维持细胞的正常生长和新陈代谢。这些生物硫醇的异常值可能导致许多健康障碍。硫化氢(H2S)作为最简单的生物硫醇，也被认为是活体动物体内的第三种气体信号分子。许多疾病如唐氏综合症、阿尔茨海默氏症、肝硬化、高血压和糖尿病都与生活系统中异常水平的H2S密切相关。半胱氨酸(Cys)异常可导致生长缓慢、肝损伤、水肿、皮肤损伤、嗜睡、肌肉和脂肪减少。谷胱甘肽(GSH)是心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症的危险因素。因此，对这些生物硫醇的鉴别具有重要意义和应用价值。对于传统的生物硫醇检测方法如高效液相色谱法、电化学检测法、质谱法、毛细管电泳法等已有报道，但它们也同时由于存在着成本高、复杂难懂、破坏组织或细胞、操作繁琐等众多缺点的原因而限制了这些方法的实际应用。荧光检测技术是各种检测技术中重要的一种检测方法，这主要是由于荧光探针具有操作简单、选择性和灵敏度高、检测限低、实时、无损、细胞内检测等特点。在许多检测生物硫醇的光学探针中，有的只用于检测一种生物硫醇(Cys、H2S或GSH)，而没有对它们进行区分，然而，有些探针可以达到区分的目的，但由于其发射波长较短，不能在生物体内应用。因此，设计荧光探针对长发射波长生物硫醇的鉴别具有重要意义。
技术实现思路
针对目前检测生物硫醇探针不能用于生物体的问题，本专利技术提供一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针，能够检测细胞、斑马鱼以及裸鼠内源性及外源性硫醇。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针，其化学名称为9-（二乙基氨基）-3-（（7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基）氧基）-5H-苯并[a]吩恶嗪-5-酮，简称为NN，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）在0-5℃下，3-(二乙基氨基)苯酚与NaNO2在浓硫酸存在下反应，产物以4mol/L的HCl溶液洗涤，抽滤干燥后获得黄色粉末状化合物1：；（2）N2气保护下，化合物1和1,7-二羟基萘在DMF中回流反应，反应结束后旋干溶液，得到粗产物，再用乙醚和甲醇冲洗粗产物，提纯得化合物2：，即Nile-OH；（3）4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑加入化合物2和三乙胺的二氯甲烷溶液，在N2气保护下室温反应，反应结束后旋干溶液并提纯得到探针。步骤（2）中，提纯步骤为粗产物以体积比为50:1:5的二氯甲烷：甲醇：冰醋酸为淋洗液过硅胶柱。步骤（3）中，提纯步骤为粗产物以二氯甲烷为淋洗液过硅胶柱。一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中Cys和GSH/H2S试剂中的应用。所述生物体包括斑马鱼和裸鼠。本专利技术的机理如下：本专利技术通过醚键将NBD(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑)基团连接到近红外发射的Nile-OH基团上得到探针NN，根据光诱导电子转移(PET)原理可知探针NN是没有荧光的，Nile-OH和NBD(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑)片段分别被选择为识别单元和荧光猝灭基团。检测时，探针结构将被生物硫醇切断，生成Nile-OH和硫醇-NBD。当非荧光探针NN被Cys切断时，由于顺序亲核取代反应，反应系统首先会生成近红外发射的Nile-OH和无荧光的硫醇-NBD，然后硫醇-NBD会迅速发生分子内Smiles重排，产生强黄绿色发射的氨基-NBD(NBD-Cys)。然而，在GSH/H2S与探针反应的时，非荧光体系可以产生近红外发射的Nile-OH以及无荧光的硫醇-NBD(NBD-GSH或NBD-H2S)，由于动力学中大环过渡态的形成失败导致Smiles重排无法进行，因此NBD-GSH或NBD-H2S不会发出荧光。综上所述，可以利用这种不同的荧光发射模式来区分Cys和GSH/H2S。本专利技术所述荧光探针的水溶液，在Cys存在下，所发射的荧光由655nm的弱荧光发射（近红外）变成了559nm和655nm的强荧光发射，该现象说明探针对Cys有响应，当与GSH/H2S反应时，则只有655nm这一荧光发射峰强度增加明显。这一现象表明该探针能够在水溶液中区分和检测Cys和GSH/H2S：。本专利技术具有以下优点：本专利技术的探针能够利用不同的荧光发射模式来区分Cys和GSH/H2S，并将其应用在细胞、斑马鱼和裸鼠的硫醇检测成像中。本专利技术的探针合成步骤简单、成本低。本专利技术的探针能够在Cys和GSH/H2S的检测中发挥重要作用。附图说明图1：探针的1HNMR谱；图2：探针的高分辨质谱；图3：探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图，探针浓度：10µM；图4：探针所检测不同浓度的不同硫醇的滴定实验；其中激发波长为575nm或510nm；探针的浓度：10µM；图5：探针在磷酸缓冲液中的选择性，其中激发波长为575nm；探针的浓度：10µM，选择性离子的浓度为2.5mM；图6：探针在细胞中的成像应用。激发波长：405nm，561nm，647nm发射波段：425-475nm和663-738nm；图7：探针在斑马鱼中的成像应用，激发波长：405nm,561nm，647nm发射波段：425-475nm和663-738nm；图8：探针在裸鼠中的成像应用，激发波长：580nm发射波段：660nm。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）化合物1的合成0℃下，将H2O：浓HCl=1:1.75(4mL:7mL)倒入到100mL圆底反应瓶中，称取3-(二乙基氨基)苯酚（6.8g，0.05mmol）加入到圆底烧瓶中，待溶解后，称取NaNO2(3.4g，0.05mmol)溶解到10mLH2O中，逐滴滴入到装有3-(二乙基氨基)苯酚的圆底烧瓶中，2小时加完，将棕色浆液反应体系保持在0-5℃的条件下，搅拌3.5h，抽滤，并用4mol/L的HCl水溶液洗涤，将产物干燥，用乙醇重结晶，得到棕黄色粉末，产率67%；（2）化合物Nile-OH（化合物2）的合成称取化合物1（230mg，1mmol）和1,7-二羟基萘（160mg，1mmol）溶于干燥的DMF溶液中，N2气保护下140℃回流反应4小时，旋干溶剂，用适量乙醚和甲醇洗涤产物，过柱纯化(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=50:1:5)后得到蓝色固体，即化合物2：Nile-OH，产率59%；（3）探针NN的合成称取Nile-OH（33.4mg，0.1mmol）溶于适量的干燥二氯甲烷溶液中，加入Et3N（15μL，0.11mmol），N2气保护下室温搅拌5分钟，然后加入（23.9mg，0.12mmol），继续室温反应，待反应完成后，旋干溶剂，用二氯甲烷过柱纯化产物，得到蓝紫色固体，产率35%；其1HNMR图谱如图1，高分辨质谱如图2。实施例2荧光探针对不同硫醇的响应配制浓度为1mM的本专利技术所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区分Cys和GSH/ H2S的近红外发射荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在0-5℃下，3-(二乙基氨基)苯酚与NaNO2在浓硫酸存在下反应，产物以4mol/L的HCl溶液洗涤，抽滤干燥后获得黄色粉末状化合物1：；（2）N2气保护下，化合物1和1,7-二羟基萘在DMF中回流反应，反应结束后旋干溶液，得到粗产物，再用乙醚和甲醇冲洗粗产物，提纯得化合物2：；（3）4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，朱琳琳，张天歌，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37