一种固液结合制备齐考诺肽的方法技术

本发明专利技术涉及多肽合成领域，本发明专利技术采用固液结合的方法制备齐考诺肽，能够很好的避免杂质肽的产生，提高粗肽纯度，降低生产成本。本发明专利技术首次采用二肽单体Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Gly‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑Met‑OH和Fmoc‑Gly‑Ser(tBu)‑OH固相合成齐考诺肽；同时引入半胱氨酸单体Fmoc‑Cys(tButhio)‑OH和Boc‑Cys(tButhio)‑OH参与合成齐考诺肽，避免了线性肽裂解过程中巯基被氧化，能够有效的提高线性肽的纯度，从而提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。

A Solid-liquid Combination Method for the Preparation of Zikonopeptide

【技术实现步骤摘要】
一种固液结合制备齐考诺肽的方法
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液结合制备齐考诺肽的方法。
技术介绍
齐考诺肽(ziconotide)是由爱尔兰Elan公司研制的一种N-型钙通道阻滞剂，是从圆锥型蜗牛软体动物体内分离出的芋螺毒素，可用于鞘内给药的非阿片类镇痛药物。齐考诺肽注射液(商品名：PRIALT)于2005年1月11日首次在美国获批上市，并于2006年相继在英国、爱尔兰和德国上市，于2007年在瑞典上市，之后在奥地利、比利时、希腊、荷兰、卢森堡、意大利、西班牙、葡萄牙、丹麦、芬兰、法国等多国上市，适用于适合鞘内注射而其他治疗方法(比如全身性镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛的成人患者的治疗，相比于阿片类镇痛药物，具有疗效好、无耐药性和无成瘾性等优势。齐考诺肽是由3对二硫键连接在内的25个氨基酸组成的多肽，分子量为2639.12，肽序较长且结构复杂，C1-C16、C8-C20和C15-C25三对二硫键使多肽折叠成为ω结，除此之外还有3股β折叠进一步稳定其空间结构。其氨基酸序列和二硫键桥接模式如下所示：齐考诺肽的合成，国内多采用固相Fmoc化学法合成，CN101412752B，CN102268082B，CN107216374A和CN106496315A采用3对不同保护基保护半胱氨酸，分步形成3对二硫键，采用此策略合成，合成周期长，收率较低；采用Fmoc-Cys(TButhio)-OH合成肽树脂，裂解后一步氧化形成3对二硫键，采用碘氧化，会对齐考诺肽肽链造成破坏，导致收率降低；CN103304655A中线性肽的合成使用了Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Gly-OH共3种二肽片段作为原料，避免了[+Gly]-齐考诺肽和[-Gly]-齐考诺肽杂质的产生；CN104974237B和CN109021087A采用片段合成法，固液结合合成齐考诺肽，有效的提高了粗肽纯度，但是会造成合成成本的提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)合成二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH；(b)以氨基树脂为固相载体，依次和偶联，得到肽树脂；(c)裂解得到巯基被保护的线性肽：H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2；(d)脱掉巯基侧链保护基并一步氧化成三对二硫键，得到齐考诺肽，经纯化、冻干得精肽。优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH溶解于碱性溶液中；低温下向该溶液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂的溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH。优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Ala-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将丙氨酸溶解于配置好的碱性溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ala-OH。优选的，步骤(a)中Fmoc-Leu-Met-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将甲硫氨酸溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Leu-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Leu-Met-OH。优选的，步骤(a)中Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Ser(tBu)-OH溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-Osu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH。更为优选的，所述的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；也可以是三乙胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；所述的有机溶剂可以是四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。优选的，步骤(b)所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的Rinkamideresins、RinkamideAM-resins和Rinkamide-MBHAresins中的一种；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA中的一种。优选的，所述步骤(c)中，裂解所用的试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和TIS中的一种或几种。优选的，所述步骤(d)中，脱掉巯基侧链保护基并一步氧化形成三对二硫键，得到齐考诺肽的具体操作步骤为：步骤(c)所得到巯基被保护的线性肽溶解在盐D的溶液中，待完全溶解后，加入脱tButhio试剂，搅拌反应；然后加入胱氨酸或氧化型谷胱甘肽，低温下静置。更为优选的，所用的盐D为碳酸氢铵、醋酸铵、柠檬酸铵、甲酸铵、碳酸铵、醋酸三乙胺、柠檬酸三乙胺盐中的一种；脱tButhio试剂为DTT、EDT中的一种。相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术首次采用二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH固相合成齐考诺肽；同时引入半胱氨酸单体Fmoc-Cys(tButhio)-OH和Boc-Cys(tButhio)-OH参与合成齐考诺肽，避免了线性肽裂解过程中巯基被氧化，能够有效的提高线性肽的纯度，从而提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。具体实施方式下面用具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不限定本专利；根据本专利技术改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本专利技术的保护范围内。说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：Fmoc9-芴甲氧羰基tBu叔丁基Pbf2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基Trt三苯甲基DCM二氯甲烷DMFN，N-二甲基甲酰胺DIPEAN，N-二异丙基乙胺DICN，N-二异丙基碳二亚胺HBTU苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)合成二肽单体Fmoc‑Gly‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Gly‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑Met‑OH和Fmoc‑Gly‑Ser(tBu)‑OH；(b)以氨基树脂为固相载体，依次和

【技术特征摘要】
1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)合成二肽单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Leu-Met-OH和Fmoc-Gly-Ser(tBu)-OH；(b)以氨基树脂为固相载体，依次和偶联，得到肽树脂；(c)裂解得到巯基被保护的线性肽：H-Cys(tButhio)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(tButhio)-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys(tButhio)-Cys(tButhio)-Thr-Gly-Ser-Cys(tButhio)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(tButhio)-NH2；(d)脱掉巯基侧链保护基并一步氧化成三对二硫键，得到齐考诺肽，经纯化、冻干得精肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH溶解于碱性溶液中；低温下向该溶液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂的溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Lys(Boc)-OH。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中Fmoc-Gly-Ala-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将丙氨酸溶解于配置好的碱性溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Gly-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Gly-Ala-OH。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中Fmoc-Leu-Met-OH合成的具体操作步骤为：在低温浴下将甲硫氨酸溶解于配置好的碱溶液中，低温下向该反应液中滴加Fmoc-Leu-OSu/有机溶剂溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Leu-Met-OH。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李同金，赵传海，马程云，周勇，翟涛，
申请(专利权)人：山东汉泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37