本申请公开了一种苯巴比妥衍生物及其在免疫检测中的用途。具体而言，本申请涉及一种苯巴比妥衍生物及其制备方法，以及与含有上述苯巴比妥衍生物的试剂盒及其配制方法。本申请的技术方案使用了一种新型的苯巴比妥衍生物，并使用了选择性较高的马来酰亚胺‑巯基的偶联方法，使衍生物和酶进行一比一偶联，大大降低了常规偶联过程所形成的批间差。由此方法得制得的苯巴比妥试剂有较好的特异性，与常见超过20种的药物无明显交叉反应。本申请的苯巴比妥检测试剂盒简便、快捷、成本低，可以在多种主流机型上进行自动化检测。
A Phenobarbital Derivative and Its Application in Immunoassay
【技术实现步骤摘要】
一种苯巴比妥衍生物及其在免疫检测中的用途
本申请涉及一种苯巴比妥衍生物及其制备方法、一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
苯巴比妥(Phenobarbital)结构式如下所示：苯巴比妥又名鲁米那、迦地那，呈白色有光泽结晶状粉末，常温下暴露于空气中性质稳定，难溶于水，不溶于酸，能溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。苯巴比妥具有镇静、催眠、抗惊厥作用，并可抗癫痫，对癫痫大发作与局限性发作及癫痫持续状态有效，并能诱导肝脏微粒体葡萄糖醛酸转移酶活性，促进胆红素与葡萄糖醛酸结合，降低血浆胆红素浓度，治疗新生儿脑核性黄疸。由于其具有镇静、催眠等生物学功能，一直在临床上被用作为抗癫痫药物。然而，正是因为有这些功能，苯巴比妥又被不法商人非法添加在助眠类保健食品中牟取不法利益，苯巴比妥存在致畸致癌等毒性作用。对中枢神经的抑制作用随着剂量加大，表现为镇静、催眠、抗惊厥及抗癫痫。大剂量对心血管系统、呼吸系统有明显的抑制。过量可麻痹延髓呼吸中枢致死。体外电生理实验见苯巴比妥使神经细胞的氯离子通道开放，细胞过极化，拟似γ-氨基丁酸(GABA)的作用。治疗浓度的苯巴比妥可降低谷氨酸的兴奋作用，加强γ-氨基丁酸的抑制作用，抑制中枢神经系统单突触和多突触传递，抑制痫灶的高频放电及其向周围扩散。苯巴比妥口服后，在消化道吸收完全但较缓慢，注射后0.5至1小时起效，一般2至18小时血药浓度达到峰值。吸收后分布于体内各组织，血浆蛋白结合率约为40％(20％至45％)。有效血药浓度约为10至40μg/ml，超过40μg/ml即可出现毒性反应。成人半衰期(t1/2)约为50至144小时，小儿约为40至70小时，肝肾功能不全时半衰期延长。约48％至65％的苯巴比妥在肝脏代谢，转化为羟基苯巴比妥。苯巴比妥为肝药酶诱导剂，提高药酶活性，不但加速自身代谢，还可加速其他药物代谢。大部分与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，由肾脏排出，有27％至50％以原型从肾排出。目前国内市场苯巴比妥药物检测的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。HPLC法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。专利申请CN102323414A描述了一种苯巴比妥均相酶免疫检测试剂盒，其包含苯巴比妥衍生物特异的多克隆抗体和葡萄糖六磷酸脱氢酶(G6PD)标记的苯巴比妥衍生物；其中所述G6PD标记的苯巴比妥衍生物能与所述苯巴比妥衍生物特异抗体特异性结合。其中，所述G6PD标记的苯巴比妥衍生物的制备包括以下步骤：a)将15mgG6PD溶解于12mLTris缓冲液(pH9.0、0.05mol/LTris、3.3mmol/L氯化镁、145.4mmol/L氯化钠)中，然后依次加入225mg还原型辅酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亚砜；b)将10mg苯巴比妥衍生物溶解于420μL二甲基亚砜和180μL二甲基甲酰胺中，加入6μL三丁胺和350μL氯甲酸异丁酯在2-8℃条件下搅拌30分钟；c)将前述a和b步骤所得溶液混合，在2-8℃条件下搅拌12-16小时，并将偶联物进行G-25凝胶层析柱纯化，得到G6PD标记的苯巴比妥衍生物。然而，现有技术的方法依赖于对苯巴比妥的反应基团(如羧基)进行激活，之后再与酶进行反应。这样的策略难以保证定向反应，也难以实现衍生物和酶之间进行1：1偶联，而导致批间差不稳定。因而，本领域仍需一种改进的苯巴比妥衍生物，以及一种改进的偶联方法。
技术实现思路
根据一些实施方案，提供了一种苯巴比妥衍生物，其具有式I所示的结构：其中n为1至10的整数，优选2至6的整数；m为1至10的整数，优选1至5的整数。在一些具体的实施方案中，苯巴比妥衍生物具有式II所示的结构：根据一些实施方案，提供了一种酶标记物，其包含根据本申请的苯巴比妥衍生物和酶。在一些具体的实施方案中，酶和所述苯巴比妥衍生物共价结合。在一些具体的实施方案中，酶为葡萄糖六磷酸脱氢酶。根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含根据本申请的苯巴比妥衍生物。根据另一些实施方案，提供了一种试剂，其包含根据本申请的酶标记物。根据一些实施方案，提供了一种酶标记物的制备方法，其包括步骤：1)提供根据本申请的苯巴比妥衍生物，尤其是在非质子性溶剂中提供苯巴比妥衍生物；2)提供酶，优选在缓冲液中提供酶；3)在18℃至28℃，按照苯巴比妥衍生物：酶＝1：1至1：500的摩尔比(优选1：50)，将所述苯巴比妥衍生物和所述酶接触1小时至4小时(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4小时，或之间的任何值)，使得所述苯巴比妥衍生物和所述酶发生偶联，得到酶标记物。在一些具体的实施方案中，根据需要对制得的酶标记物进行纯化，例如但不限于脱盐处理。在本申请上下文中，步骤编号不应理解为步骤的操作顺序。在一些具体的实施方案中，步骤1)和2)可互换顺序。在一些实施方案中，在缓冲液中提供酶，所述缓冲液选自：PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液pH为6.0至8.0。在一些实施方案中，非质子性溶剂提供反应媒介环境，其选自以下一种或组合：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。在一些实施方案中，酶为葡萄糖六磷酸脱氢酶；尤其是在偶联之前，酶包含至少一个游离的巯基，以允许进行偶联反应。在具体的实施方案中，提供一种酶标记物的制备方法，其包括步骤：1)将苯巴比妥衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中；2)将含有一个游离巯基的葡萄糖六磷酸脱氢酶溶于缓冲液中；3)将步骤1)和步骤2)的溶液混合，在18℃至25℃下充分震荡2至3小时；4)脱盐处理，得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物。根据一些实施方案，提供了根据本申请方法制备所得的酶标记物。根据一些实施方案，提供了一种苯巴比妥检测试剂盒，其包含：-第一试剂，其包含根据本申请的酶标记物；-第二试剂，其包含抗苯巴比妥抗体，其源自：小鼠、大鼠、猫、犬、灵长类、牛、马、羊、骆驼科、禽、人；所述抗苯巴比妥抗体选自：单抗、多抗、重组抗体、嵌合抗体、抗原结合片段；-任选，质控品；和/或-任选，校准品。在一些实施方案中，质控品包含2μg/ml至70μg/ml苯巴比妥，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml(或之间的任意值)苯巴比妥。在一些实施方案中，校准品包含0μg/ml至100μg/ml苯巴比妥，例如0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100μg/ml(或之间的任意值)苯巴比妥。在一些实施方案中，苯巴比妥检测试剂盒，其包含：-第一试剂，其包含：10ng/mL至500ng/mL葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物、30mM至80mMTAPS缓冲液、50mM至120mMNaCl、0.05％至0.2％w/v防腐剂、0.05％至0.2％w/v稳定剂；-第二试剂，其包含：0.5mg/L至5.0mg/L抗苯巴比妥抗体、30mM至80mMTris缓冲液、50mM至120mMNaCl、0.05％至0.2％w/v防腐剂、0.05％至0.2％w/v稳定剂。根据一些实施方案，提供了本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苯巴比妥衍生物，其具有式I所示的结构：
【技术特征摘要】
1.一种苯巴比妥衍生物，其具有式I所示的结构：其中n为1至10的整数，优选2至6的整数；m为1至10的整数，优选1至5的整数；优选，所述苯巴比妥衍生物，其具有式II所示的结构：2.一种酶标记物，其包含：-权利要求1所述的苯巴比妥衍生物、和-酶；其中，优选，所述酶和所述苯巴比妥衍生物共价结合；所述的酶为葡萄糖六磷酸脱氢酶。3.一种试剂，其包含：权利要求1所述的苯巴比妥衍生物、和/或权利要求2所述的酶标记物。4.一种酶标记物的制备方法，其包括步骤：1)提供权利要求1所述的苯巴比妥衍生物，优选在非质子性溶剂中提供权利要求1所述的苯巴比妥衍生物；2)提供酶，优选在缓冲液中提供酶；3)在18℃至28℃，将所述苯巴比妥衍生物和所述酶接触1小时至4小时，优选2小时至3小时，使得所述苯巴比妥衍生物和所述酶发生偶联，得到所述酶标记物；4)任选，对所述酶标记物进行纯化，优选脱盐；步骤1)和2)可互换；所述缓冲液选自：PBS、Tris、TAPS、TAPSO，所述缓冲液pH为6.0至8.0；所述非质子性溶剂选自以下一种或组合：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜；所述的酶为葡萄糖六磷酸脱氢酶；优选，在偶联之前，所述酶包含至少一个游离的巯基；更优选，所述酶的第56位氨基酸取代为半胱氨酸；步骤3)中，所述苯巴比妥衍生物和所述酶的摩尔比范围为1：1至1：500；优选1：50。5.根据权利要求4所述的酶标记物的制备方法，其包括步骤：1)将权利要求1所述的苯巴比妥衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中；2)将含有一个游离巯基的葡萄糖六磷酸脱氢酶溶于缓冲液中；3)将步骤1)和步骤2)的溶液混合，在18℃至25℃下充分震荡2至3小时；4)脱盐处理，得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的苯巴比妥衍生物。6.一种酶标记物，其是权利要求4或5所述方法制备得到的。7.一种试剂，其包含权利要求6所述的酶标记物。8.一种苯巴比妥检测试剂盒，其包含：-第一试剂，其包含缓冲液、权利要求2或6所述的酶标记物；-第二试剂，其包含缓冲液、...
【专利技术属性】
技术研发人员：张启飞，金石，龚俊，王贵利，封建新，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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