一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，以来曲唑逆转的XX♂雄性黄颡鱼与XX♀雌性黄颡鱼人工繁殖的子代在高温处理下，性别决定方式由遗传性别决定变为温度控制性别为主，具体方法为：从第7日龄到15日龄在32‑34℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，全雌黄颡鱼经高温处理后逆转为XX♂雄性黄颡鱼。该方法适用于工厂化温控生产雄性黄颡鱼苗，雄性逆转率高达99%，存活率高达95%。

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法
本专利技术属于鱼类遗传育种
，具体涉及一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，适用于工厂化温控生产雄性黄颡鱼苗和黄颡鱼全雌配套系生产。
技术介绍
黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)隶属于鲇形目，鲿科，黄颡鱼属，是我国重要的淡水经济鱼类之一。近年来，我国科研人员对黄颡鱼生殖调控和品种改良进行了大量研究。由于黄颡鱼雄性比雌性生长快2-3倍，刘汉勤等[1]通过性激素处理结合丹成等[2]开发的黄颡鱼性别连锁分子标记成果筛选出YY超雄黄颡鱼。YY超雄黄颡鱼与普通XX雌性黄颡鱼繁殖得到的XY全雄黄颡鱼。生产XY全雄黄颡鱼需使用雌激素来生产XY和YY生理雌性黄颡鱼，而农业部公布的NY5071-2002《无公害食品渔用药物使用准则》规定了禁止雌激素在水产品中使用，此外各个家系的维持成本大。大多数鱼类的性别决定为遗传性别决定，极少数鱼类存在遗传性别决定和环境性别决定共存的现象，如半滑舌鳎和银鲫，它们的后代性别比例容易受到温度的影响。目前还没有效的方法能够诱导鱼类从遗传性别决定到环境(温度)性别决定。Zhang等[3]利用高温处理XY♂与XX♀繁殖的黄颡鱼仔鱼的性比接近1:1，高温对黄颡鱼的遗传性别决定几乎没有影响；而且野生和养殖群体中均未发现XX♂伪雄鱼。目前普遍使用17α-甲基睾酮(MT)定向诱导鱼类性腺向精巢分化来生产伪雄鱼，但本实验室已研究了不同浓度的17α-甲基睾酮(MT)，发现MT不能逆转为功能性精巢，另外芳香化酶抑制剂来曲唑(LZ)处理黄颡鱼鱼苗并结合黄颡鱼性别连锁分子标记筛选发现仅20％左右的XX雌鱼逆转为雄性黄颡鱼[4]，在后来的繁殖过程中发现伪雄黄颡鱼性腺存在退化现象，而且处理效果不稳定。本专利技术首次发现利用来曲唑(LZ)诱导的性逆转促使黄颡鱼从遗传性别决定向环境(温度)性别决定转换，常温下XX雄性黄颡鱼和XX雌鱼交配的子一代全部为雌性；但高温32-34℃处理能够诱导出接近100％比例的XX雄鱼。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，首次以来曲唑(LZ)逆转的XX♂雄性黄颡鱼与XX♀雌性黄颡鱼繁殖的XX子一代为研究对象，通过摸索温度处理梯度和处理时间，以最佳组合方式建立了高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，包括以下步骤：(1)来曲唑诱导：XX♀雌性黄颡鱼和XY♂雄性黄颡鱼人工繁殖的子代通过来曲唑诱导进行性逆转，分子标记筛选出XX♂雄性黄颡鱼；(2)温度诱导：将上述方法获得的XX♂雄性黄颡鱼与XX♀雌性黄颡鱼进行人工繁殖，子代从第7日龄到15日龄在32-34℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，全雌黄颡鱼经高温处理后逆转为XX♂雄性黄颡鱼。优选地，步骤(2)中子代从第7日龄到60日龄在34℃培育，雄性逆转率为高达99％。优选地，步骤(2)中子代从第7日龄到15日龄在32℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，雄性逆转率为95％，存活率高达95.54％。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术首次通过32-34℃处理XX♂黄颡鱼与XX♀黄颡鱼的子一代即可逆转成XX♂雄性黄颡鱼，逆转率高达99％，相比现有技术中使用激素性逆转，其逆转率显著提高。与常规的XY全雄黄颡鱼的生产相比，本专利技术更为生态环保、简单和高效，仅需一个家系即可在常温生产全雌配套系，也可工厂化温控生产雄性黄颡鱼苗。本专利技术首次在鱼类中成功诱导从遗传性别决定向环境(温度)性别决定转换，为鱼类性别控制和单性育种提供新的技术途径。附图说明图1：性腺结构和组织切片图；PO：初级卵母细胞，SZ：精子。图2：60日龄性腺结构统计图。图3：雄性和全雌黄颡鱼生产工艺图；YSM、XSM：黄颡鱼性别连锁分子标记。具体实施方式为了更清楚的了解本专利技术的技术方案，通过以下具体实施例对本专利技术进一步描述。实施例1：来曲唑(LZ)诱导获得XX♂雄性黄颡鱼1.人工繁殖亲本挑选：挑选体表色泽正常，游泳活泼，腹部膨大、饱满、柔软和卵巢轮廓明显且有下坠感，生殖孔变圆且微红的XX♀雌性黄颡鱼和体型瘦长，生殖突突出、膨大、末端较尖有明显红点XY♂雄性黄颡鱼。人工催产：催产药物剂量按鱼的体重计算为：第一针为LHRH-A220ug/kg；第二针为LHRH-A210-14ug/kg+HCG2500IU-2900IU+DOM6mg-8mg/kg。雄鱼仅注射第二针，注射剂量与雌鱼相同。注射方式：第一、第二针每尾各注射0.3～0.6ml(0.7％的生理盐水配制)，可根据亲鱼的大小调整。一般雌性黄颡鱼注射两针(胸鳍基部注射)，两针时间间隔8-12h，雄鱼仅注射第二针。人工授精：1)采卵：从鱼框中拿出鱼，用毛巾将生殖孔附近水擦干，左手食指和中指由头部向下握住亲鱼左右胸鳍，右手拇指和食指从腹部由上往下轻、缓的挤压，将鱼卵挤入钵中，如没有挤完，可重复1-2次；2)取精：用毛巾擦干雄鱼体表水，先用剪刀剪开两侧鱼鳃，头向下倾斜放血，避免取精巢时血液污染精巢，再沿泄殖孔向上剪开腹部用镊子拨开内脏，取出精巢称重后放入4℃的精子保存液中存放；取出精巢放入匀浆器或研钵中研磨成白色浆状；3)授精：一般按1g精巢配120万卵，先称取相应的数量的卵，根据精卵配比取出相应的精液加入鱼卵中，快速搅拌10s，再加入足量水激活精子，之后快速搅拌均匀，约2min后即可进行脱粘作业；4)脱粘：先将泥浆倒入盆中加水(泥浆：水体积比为1：3)，用手搅拌均匀，将受精卵倒入脱粘盆中，搅动3～4min后鱼卵粘性消失；或将泥浆水和卵倒入倒锥形脱粘桶中气动脱粘，持续时间与前者相同。孵化及出苗：将清洗干净的受精卵倒入孵化桶中，每桶可放120万枚卵左右。孵化桶为倒锥形的桶身和桶罩(60目筛绢布做成)和相关附件组成，体积为250L，下方进水、充气，上端出水。进水和充气应使受精卵在桶中轻轻翻滚、底部无堆积适宜。水流速度一般为0.3L/S。先关掉水阀、气阀待鱼苗沉入桶底后，采用虹吸的方式将鱼苗吸入带水的容器中。注意虹吸时装鱼容器水位高度与孵化桶的落差高度为1m最佳。2.来曲唑(LZ)诱导实验鱼苗出膜后3d用丰年虫开口，7日龄进行药物处理实验。在7—29日龄期间用LZ(100、300和1000μg/L)浸泡丰年虫1h后再投喂。在30—60日龄期间，LZ(100、300和1000mg/kg)拌入微粒饲料后再投喂(饲料购自湖州亿盛饲料有限公司，主要成分：粗蛋白≥45.0％，粗脂肪>5.0％，粗纤维≤6.0％，灰分≤15.0％，水分≤10.0％)。LZ溶于95％的乙醇，拌入微粒饲料后于40℃中烘干4h，对照组仅加入95％乙醇。实验共4个组:0(对照组)、LZ100、LZ300和LZ1000。每组3个平行，每个平行随机放入300尾鱼苗。结果：投喂浓度为LZ300和LZ1000组对XX黄颡鱼的逆转率分别为20％，30％，LZ100组则不能逆转。3.分子标记筛选提取黄颡鱼基因组DNA，性别鉴定的PCR引物来源于Dan等[2]分离得到的黄颡鱼性染色体连锁标记YSM和XSM，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用凝胶成像系统依据片段长度鉴别出XY和XX，XY为2条带(826和95本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)来曲唑诱导：XX♀雌性黄颡鱼和XY♂雄性黄颡鱼人工繁殖的子代通过来曲唑诱导进行性逆转，分子标记筛选出XX♂雄性黄颡鱼；(2)温度诱导：将上述方法获得的XX♂雄性黄颡鱼与XX♀雌性黄颡鱼进行人工繁殖，子代从第7日龄到15日龄在32‑34℃培育，从第16日龄到60日龄在34℃培育，全雌黄颡鱼经高温处理后逆转为XX♂雄性黄颡鱼。

【技术特征摘要】
1.一种高效生产XX♂雄性黄颡鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)来曲唑诱导：XX♀雌性黄颡鱼和XY♂雄性黄颡鱼人工繁殖的子代通过来曲唑诱导进行性逆转，分子标记筛选出XX♂雄性黄颡鱼；(2)温度诱导：将上述方法获得的XX♂雄性黄颡鱼与XX♀雌性黄颡鱼进行人工繁殖，子代从第7日龄到15日龄在32-34℃培育，从第16日龄到60日...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅洁，熊阳，王帅，郭稳杰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42