罗非鱼脂肪性肝损伤模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了罗非鱼脂肪性肝损伤模型及其构建方法和应用，所述模型的构建方法包括驯化、高脂饲料的配制、诱导及检测分析步骤。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述方法采用的高脂饲料配方简单、易于操作、成分易控制、建模成功率高，且稳定、建模时间较短，有良好的应用前景；(2)本发明专利技术所构建的动物模型可用于研究多种因素引起的鱼类脂肪性肝损伤发病机制以及脂肪代谢紊乱与肝损伤的相互关系，同时可用于筛选防治鱼类脂肪肝的药物，以及评估鱼类保肝药物的药理机制。

Fatty liver injury model of tilapia and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
罗非鱼脂肪性肝损伤模型及其构建方法和应用
本专利技术属于水产养殖
，涉及一种鱼类损伤模型的构建方法，具体为罗非鱼脂肪性肝损伤模型及其构建方法和应用。
技术介绍
脂肪性肝损伤是鱼类主要的肝脏疾病之一，也是长期困扰水产养殖业的广发性病害，其诱发因素较多，如营养不平衡、环境因子胁迫、生理功能异常等均可导致鱼类肝脏脂肪过量累积和脂质代谢紊乱，进而引起肝脏病变。脂肪性肝病波及我国几乎所有主养鱼类，其危害主要包括降低生长、饲料利用率、免疫力、应激耐受性、产品感官等，对水产养殖业造成极大的负面影响。虽经多年研究和防治实践，至今尚不能得到根本遏制，其发生发展机制也未完全阐明。鉴于研究技术的限制，鱼类脂肪性肝损伤的研究进展缓慢。动物模型是研究脂肪性肝损伤发病机制、筛选有效防治药物的重要手段。在小鼠中，采用高脂饲料构建脂肪性肝损伤动物模型是当前最常用的方法，具有操作简便、重复性好的优点，但也存在造模时间长，实验成本较高等缺陷。在鱼类中，尽管已有研究显示，可通过高脂饲料诱导研究鱼类脂肪肝的发病机制，但目前关于构建鱼类脂肪性肝损伤模型的报道较少。中国专利CN201110001159.1一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法，公开了的方法包括以下步骤：1)采用腹腔注射的方式，对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后进行养殖；所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为100～200mg/ml；2)养殖过程中，投喂油脂总量为4～6％的配合饲料，养殖2～6周；由于本专利技术对草鱼注射硫代乙酰胺引起草鱼肝胰脏组织、细胞损伤，干扰草鱼的脂质代谢和能量代谢，同时投喂适当油脂含量的配合饲料，可以快速地获得脂肪性肝病的试验草鱼。该方法的不足在于：1)该方法为注射法，极易引起鱼类机械性肝损伤，同时对鱼类的应激较大；2)该方法易引起鱼类死亡(最高成活率85％)；3)该模型主要是由化学物质(硫代乙酰胺)引起的肝脏代谢紊乱而导致的肝损伤，而并未关注鱼类主要的脂肪肝病(营养性脂肪肝)的发生、发展机制，与生产实际结合不紧密。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，更好地研究脂肪性肝脏疾病发病机制以及筛选相关治疗药物而构建的一种理想动物实验模型，本专利技术提供了罗非鱼脂肪性肝损伤模型及其构建方法和应用。技术方案：罗非鱼脂肪性肝损伤模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：第1步、驯化选取健康无伤的罗非鱼，初重142.15±7.55g，养于循环水系统中进行驯化，驯化条件为：温度30±2℃；溶氧>6mg/L；pH7.4–8.1，驯化时间为2周，每日按照鱼总体重的2-3％投喂基础饲料饲料，定时投喂2次，分别为9：00和16：00；第2步、配制高脂饲料所述高脂饲料按重量份计包含以下组分：85-92份罗非鱼基础饲料、7-13份猪油、0.75-1.5份大豆油和0.25-0.5份胆固醇；第3步、诱导选取第1步驯化后的罗非鱼，投喂高脂饲料，每天两次，9:00和16:00，每天投喂量为鱼总体重的2-3％，连续投喂8-12周，获得罗非鱼脂肪性肝损伤模型；第4步、评价分析针对第3步诱导后的罗非鱼进行血清生化标志物、肝脏脂质水平、病理组织学诊断，判断模型的肝损伤程度。优选的，第2步中所述罗非鱼基础饲料为：粗蛋白28份，粗纤维11.6份，粗灰分15份，粗脂肪6份，总磷0.7份，总氨基酸1.3份。优选的，第2步所述高脂饲料按重量份计包含以下组分：85份罗非鱼基础饲料、13份猪油、1.5份大豆油和0.5份胆固醇。以上任一所述方法构建的罗非鱼脂肪性肝损伤模型。以上所述罗非鱼脂肪性肝损伤模型在鱼类脂肪肝发病机制研究模型中的应用。以上所述罗非鱼脂肪性肝损伤模型在鱼类脂肪肝药物筛选中的应用。本专利技术所述罗非鱼脂肪性肝损伤模型构建方法的原理：由于摄入脂肪过量，导致罗非鱼肝组织中脂肪沉积，进而引起肝脏脂肪代谢紊乱、氧化应激和炎症反应，最终致使肝细胞坏死以及肝组织损伤。在鱼类中，营养性脂肪肝为最主要的肝损伤疾病，其主要致病因素为营养过剩，因此本实验模型完全契合生产实践，有助于揭示鱼类脂肪肝病的发生和发展机制以及需求有效的防治措施。有益效果：(1)本专利技术所述方法采用的高脂饲料配方简单、易于操作、成分易控制、建模成功率高，且稳定、建模时间较短，有良好的应用前景；(2)本专利技术所构建的动物模型可用于研究多种因素引起的鱼类脂肪性肝损伤发病机制以及脂肪代谢紊乱与肝损伤的相互关系，同时可用于筛选防治鱼类脂肪肝的药物，以及评估鱼类保肝药物的药理机制。附图说明图1是罗非鱼肝组织病理切片HE染色图，其中A为正常对照组，B为模型组；图2是罗非鱼肝组织病理切片油红O染色图，其中A为正常对照组，B为模型组。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1(一)实验设计选取健康无伤的罗非鱼(初重142.15±7.55g)，随机分为2组：模型组和空白对照组，每组30条鱼。所有罗非鱼经适应性饲养2周后，开始正式投喂。模型组投喂高脂饲料：85％罗非鱼基础饲料、13％猪油、1.5％大豆油和0.5％胆固醇。空白对照组投喂基础饲料。两组投喂量相同，每天两次(9：00和16:00)，每天投喂量为鱼总体重的2～3％，连续投喂8周。造模4周后，罗非鱼出现脂肪肝症状，8周后，罗非鱼表现出明显的脂肪沉积和肝损伤。(二)罗非鱼肝损伤评价方法及结果分析评价方法包括血清生化标志物、肝脏脂质水平、病理组织学诊断。投喂8周后，禁食12h，然后采集血液和肝组织。1、血清生化标志物变化：血清标志物主要为谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和丙二醛(MDA)，结果如表1所示。表1高脂饲料投喂8周后血清GPT、GOT和MDA的变化GPT(IU/L)GOT(IU/L)MDA(μM)空白对照组8.23±0.916.47±0.994.74±0.33模型组23.90±1.54**13.39±1.76**6.22±0.32*表1结果显示，模型组罗非鱼的血清生化标志物水平显著高于空白对照组，表明模型组罗非鱼的肝脏出现明显损伤。2、肝脏脂质水平：游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)，结果如表2所示。表2高脂饲料投喂8周后肝组织FFA、TG和TC含量的变化表2结果显示：与空白对照组相比，模型组罗非鱼的肝脏脂质水平(FFA、TG、TC)显著升高，表明模型组罗非鱼肝脏内沉积了大量的脂质。3、组织病理学分析：HE染色切片和油红O染色切片，如图1和图2所示。图1结果显示：模型组罗非鱼肝组织出现明显的空泡、脂质变性、细胞坏死和炎性细胞浸润。图2结果进一步表明，模型组罗非鱼肝组织内大量的脂质沉积。实施例2(一)实验设计基于此动物模型，评价了小檗碱和虎杖苷对罗非鱼脂肪性肝损伤的保护作用。设置空白对照组、模型组和药物处理组(小檗碱和虎杖苷处理组)。空白对照组投喂基础饲料；模型组投喂高脂饲料(85％罗非鱼基础饲料、13％猪油、1.5％大豆油和0.5％胆固醇)；小檗碱组投喂含50mg/kg小檗碱的高脂饲料；虎杖苷组投喂含1g/kg虎杖苷的高脂饲料。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.罗非鱼脂肪性肝损伤模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：第1步、驯化选取健康无伤的罗非鱼，初重142.15±7.55g，经实验环境驯化，驯化条件为：温度30±2℃；溶氧>6mg/L；pH 7.4–8.1，驯化时间为2周，每日按照鱼总体重的2‑3％投喂基础饲料饲料，定时投喂2次，分别为9：00和16：00；第2步、配制高脂饲料所述高脂饲料按重量份计包含以下组分：85‑92份罗非鱼基础饲料、7‑13份猪油、0.75‑1.5份大豆油和0.25‑0.5份胆固醇；第3步、诱导选取第1步驯化后的罗非鱼，投喂高脂饲料，每天两次，9:00和16:00，每天投喂量为鱼总体重的2‑3％，连续投喂8‑12周，获得罗非鱼脂肪性肝损伤模型；第4步、评价分析针对第3步诱导后的罗非鱼进行血清生化标志物、肝脏脂质水平、病理组织学诊断，判断模型的肝损伤程度。

【技术特征摘要】
1.罗非鱼脂肪性肝损伤模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：第1步、驯化选取健康无伤的罗非鱼，初重142.15±7.55g，经实验环境驯化，驯化条件为：温度30±2℃；溶氧>6mg/L；pH7.4–8.1，驯化时间为2周，每日按照鱼总体重的2-3％投喂基础饲料饲料，定时投喂2次，分别为9：00和16：00；第2步、配制高脂饲料所述高脂饲料按重量份计包含以下组分：85-92份罗非鱼基础饲料、7-13份猪油、0.75-1.5份大豆油和0.25-0.5份胆固醇；第3步、诱导选取第1步驯化后的罗非鱼，投喂高脂饲料，每天两次，9:00和16:00，每天投喂量为鱼总体重的2-3％，连续投喂8-12周，获得罗非鱼脂肪性肝损伤模型；第4步、评价分析针对第3步诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾睿，殷国俊，杜金梁，曹丽萍，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32