一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法。本发明专利技术的方法，包括如下步骤：在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物；其中，所述药物为白消安，特别是以生殖孔注射方式进行多次注射。本发明专利技术的方法能够保证鲆鲽雌鱼具有较高的存活率，同时能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。

A Method of Inducing Apoptosis of Ovarian Germ Cells in Flounder Fish

【技术实现步骤摘要】
一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法
本专利技术涉及生殖细胞移植
，具体涉及一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法。
技术介绍
生殖细胞移植(GermcelltransplantationGCT)经过十多年的发展已经成为具有广泛应用的新兴生物技术，该技术在用于干细胞生物学特性、转基因等前沿科学研究的同时，在应用于鱼类性别选择育种、苗种繁育开发、濒危野生鱼类保护等产业方向也具有重大的意义。在哺乳动物中，高温对精子发生的影响已经得到了深入的研究，高温能引起鼠、牛、猪、羊等的精巢损害，精子质量的下降，胚胎生长迟滞、抑制或退化，甚至引起短时的或永久的不育；在鱼类中，高温同样能引起红鳍东方鲀、银汉鱼精巢细胞的退化和凋亡。然而，由于牙鲆雌鱼等鲆鲽鱼类卵巢中的卵母细胞个体较大，因此上述方法并不能够良好地适用于鱼类卵巢生殖细胞的凋亡；即便采用较高温度、多次处理等严苛条件对卵巢生殖细胞进行凋亡，然而此时雌鱼的存活率低，无法满足实际应用的需求。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，该方法能够保证鲆鲽雌鱼具有较高的存活率，同时能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。本专利技术提供的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，包括如下步骤：在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物。在本专利技术中，鲆鲽雌鱼采用产卵后的鲆鲽雌鱼，其为性成熟的鲆鲽雌鱼；研究发现，采用性成熟的鲆鲽雌鱼作为处理对象，易于同时实现较高的存活率和较好的凋亡效果。本专利技术对用于使生殖细胞凋亡的药物不作严格限制，只要能够使生殖细胞凋亡即可；优选地，所述药物为白消安；特别是，优选以生殖孔注射方式进行所述注射。现有技术存在针对罗非鱼、银汉鱼的高温结合白消安注射的相关方法，然而上述方法主要针对的是鱼类精原细胞；由于牙鲆等鲆鲽雌鱼中卵母细胞个体较大，因此上述适用于精原细胞凋亡的方法并不能够良好地适用于鱼类卵巢生殖细胞；即无法同时获得较高的存活率和针对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的较好凋亡效果。此外，现有的高温结合白消安注射法通常是在对罗非鱼、银汉鱼进行高温培养的同时以腹腔注射方式两次注射白消安，其中罗非鱼、银汉鱼高温培养的温度分别为35℃、25℃左右，而高温培养时间通常为35天左右；同时，现有研究发现，注射次数过高(超过两次)或高温培养时间过长(超过40天)会显著降低鱼类的存活率。专利技术人采用了上述方法对鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞进行凋亡试验，结果表明鲆鲽雌鱼死亡率高达70％以上，并且鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞的凋亡效果不佳。本专利技术人经大量研究发现，通过对产卵季节过后的鲆鲽雌鱼进行高温培养同时多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，特别是通过在高温培养阶段向产卵季节过后的鲆鲽雌鱼以生殖孔注射方式多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，能够克服上述死亡率高的问题，同时能够获得对鲆鲽雌鱼卵巢生殖细胞的良好凋亡效果；其原因可能在于，产卵季节过后的鲆鲽雌鱼的卵巢退化至Ⅱ期卵巢，生殖细胞易于受到所述药物的影响，既利于保证凋亡效果，同时能够大大降低药物剂量以提高鲆鲽雌鱼的存活率；此外，采用生殖孔注射方式能够使白消安直接作用于鲆鲽雌鱼的靶器官，进一步降低了白消安的注射剂量，从而显著提高了鲆鲽雌鱼的存活率；虽然采用多次注射的方式延长了高温培养时间，然而意外地发现该方式并未明显降低鲆鲽雌鱼的存活率，并且出乎意料地实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的良好凋亡效果。鉴于此，从而完成了本专利技术。具体地，在本专利技术中，控制所述高温培养的温度为不同鲆鲽鱼类养殖水温的极限高温温度；此外，控制所述高温培养的时间为54-72天，优选为58-68天，更优选为60-65天。在上述温度和时间下进行高温培养，有利于保证鲆鲽雌鱼的存活率，同时实现良好的卵巢生殖细胞凋亡效果。具体地，牙鲆雌鱼的高温培养的温度为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；牙鲆雌鱼的正常养殖温度为5-22℃，其中最低养殖温度为5-6℃，最适养殖温度为16-22℃。大菱鲆雌鱼的高温培养的温度为23-27℃，正常养殖温度为7-17℃，其中最低养殖温度为7-8℃，最适养殖温度为14-17℃。半滑舌鳎雌鱼的高温培养的温度为28-32℃，正常养殖温度为4-24℃，其中最低养殖温度为4-6℃，最适养殖温度为14-24℃。条斑星鲽雌鱼和圆斑星鲽雌鱼的高温培养的温度为25-28℃，正常养殖温度为2-23℃，其中最低养殖温度为2-6℃，最适养殖温度为15-23℃。针对牙鲆雌鱼的研究发现，高温培养的温度不宜过高或过低，温度过低(例如26℃以下)无法保证鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果，而温度过高(例如30℃以上)会导致鲆鲽雌鱼存活率显著降低；此外，高温培养的时间不宜过长或过短，时间过短(例如50天以下)会影响鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果，而时间过长(例如75天以上)会显著降低鲆鲽雌鱼的存活率。进一步地，本专利技术的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，在所述高温培养之前还包括：将培养温度从正常养殖温度梯度升温至所述高温培养的温度(不同鲆鲽类鱼高温培养的极限温度)；其中，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天。此外，对正常养殖温度不作严格限制，优选为适合鲆鲽雌鱼生长的温度，即鲆鲽雌鱼的最适养殖温度。梯度升温有利于鲆鲽雌鱼对温度进行逐渐适应，进而有利于保证鲆鲽雌鱼的存活率。在本专利技术中，所述注射可以分四次进行，每次注射的剂量可以为15-20mg/kg，优选为18-20mg/kg；此外，每次注射的剂量可以相同或不同。在本专利技术中，注射剂量15-20mg/kg指的是对每1kg鲆鲽雌鱼注射15-20mg药物。上述特定的注射条件能够保证鲆鲽雌鱼具有一定的存活率，并且能够实现对鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞良好的凋亡效果。进一步地，可以控制相邻两次注射的间隔时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天；此外，可以控制第四次注射后进行的高温培养的时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天。更具体地，本专利技术的方法，可以包括如下顺序进行的步骤：在产卵季节过后将鲆鲽雌鱼高温培养6-8天；对鲆鲽雌鱼第一次注射药物，随后继续高温培养12-16天；对鲆鲽雌鱼第二次注射药物，随后继续高温培养12-16天；对鲆鲽雌鱼第三次注射药物，随后继续高温培养12-16天；对鲆鲽雌鱼第四次注射药物，随后继续高温培养12-16天。在上述条件下，鲆鲽雌鱼的存活率达到60％以上，此外鲆鲽雌鱼产卵板明显萎缩，整个卵巢腔隙显著变大，产卵板无卵原细胞并且卵母细胞大量凋亡，同时性腺指数和vasa基因表达量显著降低，鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞的凋亡效果好。本专利技术的方法对于作为试验对象的鲆鲽雌鱼不作严格限制，鲆鲽雌鱼例如可以选自牙鲆雌鱼，优选为≥3龄的牙鲆雌鱼，更优选为3-6龄的牙鲆雌鱼。研究发现，该年龄阶段的性成熟牙鲆雌鱼作为受体最为合适，年龄太大的牙鲆雌鱼耐高温性能差，容易死亡；而年龄太小(例如2岁龄以内)的牙鲆雌鱼不易通过生殖孔注射方式将白消安注射到性腺中。本专利技术提供的诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，在高温培养阶段向产卵季节过后的性成熟鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物，能够出乎意料地提高牙鲆雌鱼的存活率并获得对鲆鲽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物。

【技术特征摘要】
1.一种诱导鲆鲽鱼类卵巢生殖细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：在产卵季节过后对鲆鲽雌鱼进行高温培养，在高温培养阶段向鲆鲽雌鱼多次注射用于使生殖细胞凋亡的药物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为白消安；优选地，以生殖孔注射方式进行所述注射。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制所述高温培养的温度为所述鲆鲽鱼类养殖水温的极限高温温度。4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，控制所述高温培养的时间为54-72天，优选为58-68天，更优选为60-65天。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述高温培养之前还包括：将培养温度从正常养殖温度梯度升温至所述高温培养的温度。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天。7.根据权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于，所述注射分四次进行，每次注射的剂量为15-20mg/kg，优选为18-20mg/kg。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，控制相邻两次注射的间隔时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天；优选地，控制第四次注射后进行的高温培养的时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天。9.根据权利要求1至8任一所述的方法，其特征在于，包括如下顺序进行的步骤：在产卵季节过后将鲆鲽雌鱼高温培养6-8天；对鲆鲽雌鱼第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙朝徽，任玉芹，王玉芬，张晓彦，于清海，姜秀凤，侯吉伦，王桂兴，赵雅贤，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院北戴河中心实验站，
类型：发明
国别省市：河北,13