一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，是利用固定化载体对纳他霉素产生菌进行细胞固定，并将固定获得的细胞用于下一批次发酵中，以实现纳他霉素的连续重复分批发酵。经过系统优化，被载体固定的细胞在5批次连续重复分批发酵中均可保持较高的产物合成活力。相比未进行细胞固定化的发酵组，本方法可有效提升生产强度，在工业微生物发酵领域具有较强的应用价值。

A Natamycin Fermentation Process Based on Cell Immobilization Technology

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺
本专利技术涉及一种纳他霉素的生物合成方法，具体地说是一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，属于工业生物

技术介绍
纳他霉素是一种多烯大环内酯类广谱抗真菌剂，目前主要通过链霉菌发酵合成，其生产菌主要包括恰塔努加链霉菌、褐黄孢链霉菌、利迪链霉菌和纳塔尔链霉菌。鉴于其对霉菌、酵母生长的强烈抑制效果及较高的安全性(GRAS，美国食品药品管理局认定)，纳他霉素目前已被广泛应用于抗真菌治疗、食品绿色防腐以及农业病害真菌治理等领域，具有巨大的社会需求和经济价值。目前，液态深层发酵是工业化生产纳他霉素的主要途径。为提升纳他霉素的生物合成水平，近年来学术界和产业界进行了大量的研究，其包括高产菌的选育、发酵营养条件的筛选、发酵过程工艺优化以及产物合成前体的添加等。尽管以上研究使得纳他霉素的生物合成水平大幅提高，但是产物发酵时间过长这个行业共性问题一直对纳他霉素合成效率形成制约。“如何缩短发酵时间，提升生产强度”是本领域的一个重要课题。细胞固定化是一项对细胞活动空间进行一定程度约束的轻工领域技术，指的是采用某种方法将细胞固定在水不溶的惰性载体上，使其在一定空间范围进行生长代谢，进而合成某类代谢产物。细胞固定化通常具有以下优点：1、细胞可多次利用，省去细胞生长所需的发酵底物和发酵时间，减少批次中底物消耗和能量消耗；2、对细胞进行了保护，减弱搅拌剪切力对丝状菌的影响，提高细胞存活率；3、获得更高的细胞浓度，大幅增强生产强度。
技术实现思路
为缩短纳他霉素发酵时间，提高生产强度，本专利技术提供了一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺。本专利技术针对丝状菌菌丝容易发生缠绕并相互粘连这一特点，开发出一种以褐黄孢链霉菌Z28(StreptomycesgilvosporeusZ28)为生产菌，利用疏松、表面粗糙的人造载体或天然载体进行细胞固定化，进而高效合成纳他霉素的生产方法。本专利技术方法不仅可大幅缩短发酵时间、提高生产效率，其中固定化细胞还可被多次使用进行重复分批(或补料分批)发酵，节约了细胞生长所需的底物和能量消耗，大幅降低成本，在纳他霉素生物合成中具有重要的工业应用价值。本专利技术基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，是利用固定化载体对纳他霉素产生菌进行细胞固定，并将固定获得的细胞用于下一批次发酵中，以实现纳他霉素的连续重复分批发酵。经过系统优化，被载体固定的细胞在5批次连续重复分批发酵中均可保持较高的产物合成活力。相比未进行细胞固定化的发酵组，本方法可有效提升生产强度，在工业微生物发酵领域具有较强的应用价值。本专利技术基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用补料分批发酵的方式，具体包括如下步骤：步骤1：发酵种子培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：细胞固定化载体的预处理将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状(直径3cm，厚度4mm)，预称重，记录重量；步骤3：补料分批发酵向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，固液比为6.7～10％(v/v)，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至纳他霉素合成停止；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至补料分批发酵结束；当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间。本专利技术基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用重复分批发酵的方式，具体包括如下步骤：步骤1：发酵种子培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：细胞固定化载体的预处理将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状(直径3cm，厚度4mm)，预称重，记录重量；步骤3：重复分批发酵向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，固液比为6.7-10％(v/v)，用8层纱布封口，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵；第一批次发酵进行至碳源消耗殆尽，将所有发酵液取出，仅留下固定化载体及其固定的细胞，随后加入已灭菌的新鲜纳他霉素发酵培养基，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下进行第二批次发酵；以同样的方式进行第三批次发酵、第四批次发酵、第五批次发酵，每批次均发酵至葡萄糖耗尽。所述固定化载体为人造载体或天然载体。所述人造载体包括人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶等，所述天然载体包括丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷等。所述固定化载体优选玉米芯或丝瓜络。所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH7.5。所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl5g，pH7.5。所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl5g，pH7.5。所述褐黄孢链霉菌优选为褐黄孢链霉菌Z28(StreptomycesgilvosporeusZ28)。与传统纳他霉素发酵生产方法相比，本专利技术采用细胞固定化手段重复多批次发酵生产纳他霉素的方法具有以下优点：1、能够在多批次发酵中大幅提升纳他霉素的生产强度，缩短各批次的发酵时间；2、固定化细胞在首次分批发酵过程中自然生成，不额外占用发酵时间，且此部分细胞发酵活力强，可在后期多批次分批发酵中重复使用；3、在多批次发酵模式中，只需在第一批次进行发酵罐的清洗和灭菌，后期多批次发酵期间只需进行简单的培养基更换，从而进一步提升发酵生产的效率，节约洗涤水和用于灭菌的高温蒸汽消耗。下面结合具体实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例所描述的具体的载体筛选、工艺条件以及结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本专利技术。具体实施方式本专利技术的生物反应器包括250mL三角瓶和5L液态发酵罐两种。本专利技术细胞固定化载体筛选实验均在250mL三角瓶中完成，细胞固定化补料分批发酵、重复分批发酵在5L发酵罐中进行。具体操作步骤如下：一、菌种：褐黄孢链霉菌Z28(StreptomycesgilvosporeusZ28)。二、培养基配方：1、固体贝塔纳培养基(g·L-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，pH7.5。2、液体种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母粉6，大豆蛋白胨6，NaCl5，pH7.5。3、纳他霉素发酵培养基(g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用补料分批发酵的方式，其特征在于包括如下步骤：步骤1：发酵种子培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：细胞固定化载体的预处理将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状，预称重，记录重量；步骤3：补料分批发酵向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115‑121℃灭菌20‑30min，随后接种步骤1获得的发酵种子，培养发酵直至纳他霉素合成停止；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至补料分批发酵结束；当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10‑20g/L之间。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞固定化技术的纳他霉素发酵工艺，采用补料分批发酵的方式，其特征在于包括如下步骤：步骤1：发酵种子培养将褐黄孢链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于29℃恒温培养箱中培养10天，直至长出褐黄色孢子；用接种环挑取3环孢子置于装有60mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于29℃、220rpm条件下恒温振荡培养2天；步骤2：细胞固定化载体的预处理将不同来源的固定化载体先置于100℃水浴1h，再于鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重；将干燥后的载体切割成圆片或绕成圆圈状，预称重，记录重量；步骤3：补料分批发酵向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基，于高温灭菌锅中115-121℃灭菌20-30min，随后接种步骤1获得的发酵种子，培养发酵直至纳他霉素合成停止；发酵pH值采用自动流加NaOH溶液的方式控制pH值为7.0直至补料分批发酵结束；当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/L时，外源补充60％的无菌葡萄糖溶液以维持发酵液中的糖浓度在10-20g/L之间。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述固定化载体为人造载体或天然载体；所述人造载体包括人造海绵、不锈钢丝球、尼龙线圈、大孔硅胶等，所述天然载体包括丝瓜络、玉米芯、棉线圈、麦秸秆卷等。3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述固体贝塔纳培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨2g，琼脂20g，pH7.5；所述液体种子培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖20g，酵母粉6g，大豆蛋白胨6g，NaCl5g，pH7.5；所述纳他霉素发酵培养基的配方以1L计，包括如下：葡萄糖80g，酵母粉10g，大豆蛋白胨20g，NaCl5g，pH7.5。4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤3中，向步骤2预处理后的固定化载体中加入纳他霉素发酵培养基的固液比为6.7～10％。5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤3中，以8％的接种量接种步骤1获得的发酵种子，于初始pH值7.2、温度29℃、溶氧保持在30％以上的培养条件下发酵，直至纳他霉素合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾昕，李峰，曾化伟，徐大勇，张标，信丙越，李珊珊，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34