用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体制造技术

本发明专利技术公开了用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体，本发明专利技术设计出腺苷酸环化酶基因干扰片段，双酶切pUC19‑MtPpdc‑MtTpdc载体和退火后的干扰片段进行连接，获得重组表达载体；将重组表达载体转入嗜热毁丝霉原生质体中，菌株AC1的干扰效果良好。本发明专利技术采用siRNA的DNA模板构建嗜热毁丝霉的腺苷酸环化酶干扰表达载体来沉默腺苷酸环化酶，对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控进行研究，为后续采用基因工程技术提高嗜热真菌纤维素酶产量提供理论基础。

Interfering expression vector for silencing adenylate cyclase gene in thermophilic destructive mycelia

【技术实现步骤摘要】
用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体
本专利技术属于微生物
，尤其涉及用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体。
技术介绍
随着工业机械化的不断发展以及汽车等耗能设备的大规模使用使得人们对化石等不可再生能源的需求越来越大。但是不可再生能源的数量有限且日渐枯竭，人们将目光转向于自然界中丰富的可再生资源，来缓解目前的能源压力。木质纤维素是世界上规模最大、分布范围最广、含量最丰富的一类可再生资源，主要以草木、植物落叶、农业废弃物、木材处理废料、食品加工废料、市政废物等形式存在。木质纤维素相对廉价，如果能够对其进行高效利用将其转化为各种为人类所需的能源物质，将有助于缓解目前的能源压力，减少燃烧农作物秸秆所造成的环境污染，起到一定的环境保护作用。纤维素酶是一类多组分复杂酶系。一般分为3大类，分别是内切葡聚糖酶(EG)，外切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)。三种酶通过协同作用来降解大分子纤维素产生可利用的单糖从而转化为其他能源物质。EG可以将纤维素非结晶区内部的糖苷键随机水解，产生纤维糊精和低聚糖等物质。CBH能够将纤维素链的还原端或非还原端水解，并释放出纤维二糖。BG将纤维二糖和寡糖水解，并释放可以发酵的葡萄糖。大自然中，真菌、细菌等微生物都能产生纤维素酶，但是一般应用于工业生产中的多是丝状真菌。经研究发现，与细菌产纤维素酶相比，丝状真菌产酶能力更强，所产的酶系更全、活性更高并且能够分泌到胞外。目前，能够大量分泌纤维素酶的丝状真菌有里氏木霉(Trichodermareesei)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)等，其中里氏木霉被广泛应用于工业化生产。嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)是一类耐高温的嗜热丝状子囊真菌，其最低生长温度大于等于20℃，最高生长温度可大于等于50℃。它可以产生耐高温的纤维素酶，所产生的大多纤维素酶最适温度在60-80℃之间，所以被称为生产热稳定性纤维素酶的酶工厂，也被称为潜在的高效中高温酶库。然而，嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控却少有研究，难以采用基因工程技术来提高嗜热真菌纤维素酶产量。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体，本专利技术采用siRNA的DNA模板构建热毁丝霉的腺苷酸环化酶干扰表达载体来沉默腺苷酸环化酶，对嗜热毁丝霉纤维素酶基因表达调控进行研究，为后续采用基因工程技术提高嗜热真菌纤维素酶产量提供理论基础。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。另外，本专利技术还提供实时荧光定量PCR用于检测嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因表达量的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:3～4所示。另外，本专利技术还提供一种用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的试剂盒，其包括用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。作为上述技术方案的改进，试剂盒还包括实时荧光定量PCR用于检测嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因表达量的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:3～8所示。另外，本专利技术还提供一种腺苷酸环化酶基因干扰表达载体，其包括siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。作为上述技术方案的改进，腺苷酸环化酶基因干扰表达载体包括MtPpdc-ac-MtTpdc干扰表达盒，所述MtPpdc-ac-MtTpdc干扰表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。另外，本专利技术还提供所述的腺苷酸环化酶基因干扰表达载体的构建方法，其包括以下步骤：NotI酶和XbaI酶切后的pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒和退火后的siRNA的DNA模板采用T4ligase进行连接。另外，本专利技术还提供所述的腺苷酸环化酶基因干扰表达载体在降低滤纸酶、β-葡萄糖苷酶或内切β-1,4-葡聚糖苷酶的活性中的应用。另外，本专利技术还提供所述的腺苷酸环化酶基因干扰表达载体在降低滤纸酶、β-葡萄糖苷酶基因blg2或内切β-1,4-葡聚糖酶基因egl1的表达量中的应用。另外，本专利技术还提供所述的腺苷酸环化酶基因干扰表达载体在降低磷酸二酯酶基因的表达量中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体，本专利技术对嗜热毁丝霉腺苷酸环化酶基因(ac)进行干扰，设计出3种ac基因的干扰片段，双酶切pUC19-MtPpdc-MtTpdc载体和退火后的干扰片段进行连接，获得重组表达载体(即干扰表达载体)；将重组表达载体转入嗜热毁丝霉原生质体中，仅阳性菌株AC1的干扰效果良好(AC1中siRNA的DNA模板是siRNA-ac1)：ac基因mRNA的表达量分下降43％；FPA酶活下降43％，CMC酶活下降了24％，BG酶活下降20％；bgl2、egl1的表达量分别下降24％、53％，pdemRNA表达量是野生型WT的33％。附图说明图1为pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒的双酶切电泳图；图2腺苷酸环化酶基因的干扰表达载体的图谱；图3显示12个标准转化子的PCR验证结果：干扰表达载体是否成功导入大肠杆菌中；图4显示转化子的PCR验证结果：pAN7-1质粒和干扰表达载体是否成功导入嗜热毁丝霉的原生质体；其中，1：AC1，2：AC2C，3：AC2-1，4：AC2-2，5：AC2-3，6：AC3-1，7：AC3-3，1中siRNA的DNA模板是siRNA-ac1，2～5中siRNA的DNA模板是siRNA-ac2，6～7中siRNA的DNA模板是siRNA-ac3；图5显示基本培养基第4天，嗜热毁丝霉孢子ac基因mRNA表达水量；图6显示微晶纤维素(1％)诱导条件下野生型和转化子的纤维素酶活，其中纤维酶活包括FPA酶活、CMC酶活和BG酶活；图7显示野生型和转化子主要纤维素酶基因的表达水平；图8显示WT和AC1菌株中pde基因的表达水平。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本专利技术作进一步说明。需要说明的是，本专利技术存在同一质粒采用多个名字成，如1)重组表达载体等同于干扰表达载体，2)pUC19-AC干扰表达载体等同于pUC19-MtPpdc-Mtac-MtTpdc干扰表达载体。实验材料菌株与质粒大肠杆菌(E.coliJM107):从本学院苟德明教授课题组获得；嗜热毁丝霉(M.thermophilaATCC42464):从美国菌种收藏中心(ATCC)处购买；pAN7-1质粒：含有筛选真菌的潮霉素抗性基因hphr；筛选大肠杆菌的标记氨苄青霉素抗性基因Apr的pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒：由深圳大学构建获得，其以嗜热毁丝霉基因组DNA为模板，用引物M-Ppdc-F和M-Ppdc-R扩增丙酮酸脱羧酶基因(pdc)的启动子MtPpdc(pdc基因起始密码子上游587bp序列)，用引物M-Tpdc-F和M-Tpdc-R扩增pdc基因的终止子MtTpdc(pdc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示。

【技术特征摘要】
1.用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。2.实时荧光定量PCR用于检测嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因表达量的引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:3～8所示。3.一种用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的试剂盒，其特征在于，包括用于沉默嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因的siRNA的DNA模板，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光定量PCR用于检测嗜热毁丝霉中腺苷酸环化酶基因表达量的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO:3～8所示。5.一种腺苷酸环化酶基因干扰表达载体，其特正在于，包括如权利要求1所述的siRNA的DNA模板。6.如权利要求1所述的腺苷酸环化酶基因干扰表达载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，邓婷婷，杨帆，杨扬，蔡湘湘，潘庆，来亚鹏，郑春娟，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44