一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（＋）γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种能拆分(+/‑)γ‑内酰胺得到(+)γ‑内酰胺的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018862。本发明专利技术提供的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22分离自艾溪湖，具有较高(+)γ‑内酰胺酶活性。菠萝泛菌物浓度条件下，产物(+)γ‑内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ‑内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ‑内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。本发明专利技术还提供菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22在制备(+)γ‑内酰胺和生产(+)γ‑内酰胺酶中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌及其应用。
技术介绍
γ-内酰胺的两个光学对映体都是许多碳环核苷类似物合成的手性前体。趋化因子受体抗结剂MK-0812和糖尿病候选药物美格列汀，可由(+)γ-内酰胺合成。产物(+)γ-内酰胺经溴化进行骨架重排生成(-)γ-内酰胺，以光学纯的(-)γ-内酰胺为起始化合物的酶化学合成方法，是合成阿巴卡韦和帕拉米韦这两种治疗艾滋病和禽流感及甲流感的特效药物的最简便、经济的方法。在发现微生物能选择性拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺之前，文献报道的制备光学纯的(+)γ-内酰胺一般采用化学不对称合成的方法。使用这种方法的缺点在于：原料昂贵，步骤烦琐，成本较高，且会造成较严重的环境污染，同时产物中通常含有金属杂质。与此形成鲜明对比的是，用微生物进行催化合成光学纯的(+)γ-内酰胺具有反应条件温和效率高，产物纯度高及对环境友好的特点。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的生产菌株，暂无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株及其应用。为实现上述目的，本专利技术提供一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，所述菠萝泛菌为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2018862。较佳地，所述菠萝泛菌能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌。本专利技术还提供一种上述所述菠萝泛菌在制备(+)γ-内酰胺中的应用，采用所述菠萝泛菌，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。具体地，所述以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺的具体步骤如下：(1)取微生物菌株：为所述菠萝泛菌Y22；(2)先将步骤(1)中所述的菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应。(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、蒸发浓缩、冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺。较佳地，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH为4～10，浓度为0.01～0.5mol/L。较佳地，所述步骤(4)中菌体终浓度为0.5～100g/L湿菌体，反应温度为20～60℃，反应时间为1～24h，摇床转速为100～300rpm。较佳地，所述步骤(5)中在20～80℃下蒸发浓缩、1～4℃下冷却结晶。较佳地，所述步骤(6)中所述(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。本专利技术还提供一种上述菠萝泛菌在生产(+)γ-内酰胺酶中的应用。本专利技术提供的菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22具有以下优点：(1)本专利技术提供的菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22分离自艾溪湖，具有较高(+)γ-内酰胺酶活性。菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺，在300g/L底物浓度条件下，产物(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ-内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。(2)本专利技术提供的菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22能够抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌的生长，在抑制人类致病菌中具有开发利用价值。本专利技术的菠萝泛菌Y22，保藏日期为2018年12月5日，保藏编号为CCTCCNO：M2018862，分类命名为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学。附图说明图1为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22菌落形态图；图2为金黄色葡萄球菌抑菌实验结果图；图3为痢疾杆菌抑菌实验结果图；图4为白色念珠菌抑菌实验结果图；图5为粪肠杆菌抑菌实验结果图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。需说明的是，下述实施方法是对本专利技术做的进一步解释说明，不应当作为对本专利技术的限制。本专利技术的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。实施例1能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株的筛选从艾溪湖底取污泥，筛选得到能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，具体步骤如下：(1)初培养：从艾溪湖底取污泥，用无菌水稀释后涂布于培养基上，30℃培养2d；初筛培养基为：NH4Cl2.0g，KH2PO41.5g，Na2HPO41.5g，MgSO40.2g，CaCl20.1g，(+/-)γ-内酰胺2g，微量元素100μL，琼脂粉20g；其中微量元素按照每升加入量计算包括：CaCl2·2H2O3.6g，ZnO2.0g，CuCl·2H2O0.85g，NaMoO·2H2O4.8g，MnCl2·4H2O2.0g，FeCl3.6H2O5.4g，CoCl2·6H2O2.4g；(2)挑取单菌落再次在筛选培养基上划线分离纯化单菌落；挑取单菌落形态特征为：菌落圆形，表面光滑，边缘平整，黄色，菌落质地粘稠，湿润，革兰氏染色呈阴性；(3)发酵产酶培养：先将步骤(2)中挑取出来的单菌落继续进行发酵产酶培养1～3d，发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5g，NH4Cl2.0g，KH2PO42g，Na2HPO47g，MgSO40.4g，CaCl20.01g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用；(4)将上述发酵产酶培养的菌液进行离心获得能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，备用。最终筛选得到一株具有较高(+)γ-内酰胺酶活性的微生物菌株Y22，该菌株经鉴定为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)，具有如SEQID:1所示的16srDNA序列，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2018862。菠萝泛菌Y22的菌落形态图如图1所示。实施例2菠萝泛菌Y22拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺(1)取微生物菌株：菠萝泛菌Y22；(2)先将步骤(1)中的菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能拆分(+/‑)γ‑内酰胺得到(+)γ‑内酰胺的菠萝泛菌，其特征在于：所述菠萝泛菌为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)Y22，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018862。

【技术特征摘要】
1.一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，其特征在于：所述菠萝泛菌为菠萝泛菌(Pantoeaananatis)Y22，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2018862。2.如权利要求1所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌，其特征在于：所述菠萝泛菌能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、痢疾杆菌和粪肠杆菌。3.一种如权利要求1或2所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，采用所述菠萝泛菌，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。4.如权利要求3所述的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的菠萝泛菌的应用，其特征在于，所述以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺的具体步骤如下：(1)取微生物菌株：为所述菠萝泛菌Y22；(2)先将步骤(1)中所述菠萝泛菌Y22进行离心获得湿菌体备用；(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金昌，王建军，艾国民，靳亮，关丽梅，占智高，郭燕，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36