一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。该方法中所用培养基为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/LNaCl，0.002～0.003mol/L KCL；菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油；感受态细胞分装后即刻用液氮速冻后再进行超低温保存。本发明专利技术对临床菌感受态细胞的制备工艺进行了优化，包括培养基和工艺条件的优化，培养基中不加入MgCl2/MgSO4，并筛选优化了合适配比的培养基配方，以及制备、保存条件，按照该方法制备的革兰氏阴性临床菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，解决了目前临床菌感受态制备的一个大问题，且该方法更简单高效，具有很好的应用价值和前景。

A Method for Preparing Sensitive Cells of Gram-negative Clinical Bacteria with High Conversion Rate

【技术实现步骤摘要】
一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。
技术介绍
感受态是指细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。将细菌制备成感受态有助于获取目的蛋白，有助于研究未知基因功能，同时，为实验室研究细菌遗传背景提供技术手段。感受态可分为工程菌感受态和临床菌株感受态。工程菌感受态：对细菌进行基因改造后，使细菌能够按照人们的设想工作；工程菌感受态成为实验室常用来扩增质粒、表达蛋白的工具，有利于外源基因高效表达。如常用的JM109，DH5α，BL21等，这些菌株都是工程菌株，经过人为改造，有成熟的制备感受态体系，制备起来比较简单。而临床菌株的感受态是指以直接来源于病人、动物、环境中的细菌制作的感受态。由于细菌具有很强的适应性和遗传积累的特性，在实验室研究过程，常常需要对临床菌株进行机制研究，以了解细菌在环境中进化的情况，以了解当下细菌的流行情况(比如了解当下多重耐药菌株的耐药机制)，而此时往往需要将临床菌株做成感受态来进行基因敲除和过表达验证。如多重耐药菌在全球流行，对人类的健康构成威胁，为了研究多重耐药菌的耐药机制，需要对引起病人发病的临床菌株进行机制的研究，以应对多重耐药的广泛流行的现状。然而临床菌株的遗传背景复杂，感受态的转化率低，这是目前临床菌感受态制备的一个大问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有临床菌感受态制备技术的缺陷和不足，提供一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法，所用培养基配方为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/LNaCl，0.002～0.003mol/LKCL。优选地，所用培养基配方为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.01mol/LNaCl，0.0025mol/LKCL。优选地，该方法中，菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油。优选地，该方法中，菌体的清洗和重悬均使用10％甘油。优选地，该方法中，菌体分装后即刻用液氮速冻，再进行保存。另外，具体优选地，该方法包括如下步骤：(1)获取菌株单菌落；(2)单菌落进行初培养；(3)再扩大培养至OD600nm在0.4～0.5之间；(4)步骤(3)所得菌液离心，菌体沉淀用甘油清洗；(5)按照浓缩280～320倍的要求，用甘油重悬菌体，分装后液氮速冻，超低温保存。其中优选地，步骤(4)所述离心的条件为0～8℃、3000～5000rcf离心5～15min。更优选地，步骤(4)所述离心的条件为4℃、4000rcf离心10min。优选地，步骤(5)中浓缩倍数为300倍。优选地，步骤(5)所述超低温为-100℃～-20℃(如-80℃)。更具体地，所述方法包括如下步骤：(1)获取单菌落：将菌株在无抗生素的LB琼脂培养板上划线，37℃培养15～24h后，在琼脂培养板密度低的位置选取单菌落；(2)单菌落初培养：取1个单菌落的菌体加入1～3mL培养基中，37℃、200rpm摇菌培养6～10h；(3)扩大培养把步骤(2)所得菌液按照体积比0.15％的接种量转接到新鲜的培养基中37℃、200rpm摇菌培养至OD600nm在0.4～0.5之间；(4)菌体清洗把步骤(3)所得菌液4℃、4000rcf离心10min，倒去培养基，沉淀用甘油反复清洗；(5)菌体重悬、分装保存按照浓缩倍数的要求，加入甘油重悬菌体，分装后用液氮速冻，-80℃保存。更优选地，步骤(3)中的培养瓶需要预热：培养容器37℃、200rpm预摇1～1.5h(目的是预热和使培养基充氧)。优选地，甘油需要预冷。如-4℃或-20℃预冷。优选地，步骤(3)中甘油清洗的操作重复2～3次，每次清洗时，加入甘油后在冰上轻轻摇动到把菌体完全悬浮，再离心。另外，经过大量实验验证，本方法适用于大多数的革兰氏阴性临床菌感受态细胞的制备，尤其是大肠杆菌、沙门氏菌。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术对临床菌感受态细胞的制备工艺进行了优化，包括培养基和工艺条件的优化，培养基中不加入MgCl2/MgSO4，并筛选优化了合适配比的培养基配方，以及制备、保存条件，按照该方法制备的革兰氏阴性临床菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，假阳性显著减少，解决了目前临床菌感受态制备的一个大问题，具有很好的应用价值和前景具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例11、标准菌株：大肠杆菌K122、培养基配方1L：20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2mL5MNaCl，2.5mL1MKCl(注意：本实验的培养基必须不含MgCl2/MgSO4)。配制500mL10％甘油。3、感受态细胞制备方法如下：(1)获取单菌落：第一天下午2:00：将菌株在一块LB琼脂培养板(无抗生素)上划线(保证出现密度低的多个单菌落)，37℃培养过夜。第二天上午8:00：首先开启小摇床(设定37℃)。在琼脂培养板密度低的位置选取单菌落。(2)单菌落初培养：用移液器取2μL培养基洗脱1个单菌落的菌体，加入到1管1.5mL培养基。在小摇床(设定37℃)摇菌培养(200rpm)。(3)扩大培养把1L大三角瓶放入大摇床，设定37℃、200rpm，预摇约1～1.5h(目的是预热和使培养基充氧)。下午4:30：在超净台中，将1.5mL的菌液接种到1L大三角瓶中，200rpm摇动培养约两个小时，在超净台中从三角瓶中取适量菌液加入到比色杯中测定OD600nm。培养至OD600nm在0.4～0.5之间。(4)菌体清洗把步骤(3)的菌液倒入离心瓶，4℃、4000rcf离心10min，倒去培养基。往离心瓶倒入适量预冷的10％甘油，以洗去瓶壁上的培养基残液，轻轻倒掉洗液。向瓶中加入适量的10％甘油，盖上盖，在冰上轻轻摇动到把菌体完全悬浮，4℃、4000rcf离心10min，倒去上清。重复操作甘油清洗的步骤。(5)菌体重悬、分装保存按照浓缩300倍的要求，加入1～1.5mL10％甘油，重悬菌体，分装到1.5mL离心管中，用液氮速冻，-80℃冰箱保存。实施例2将菌株换为临床菌株大肠杆菌E4，按照实施例1的方法制备感受态。实施例3将菌株换为沙门氏菌标准菌株ATCC14028，按照实施例1的方法制备感受态。实施例4将菌株换为沙门氏菌临床菌株D14，按照实施例1的方法制备感受态。实施例5整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基配方变为：18g/L胰蛋白胨，4g/L酵母提取物，0.015mol/LNaCl，0.003mol/LKCL。实施例6整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：培养基配方变为：22g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.005mol/LNaCl，0.002mol/LKCL。实施例7整体方法与实施例4相同，唯一不同之处在于：所使用甘油的浓度为8％。实施例8整体方法与实施例4相同，唯一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法，其特征在于，所用培养基的配方为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/L NaCl，0.002～0.003mol/L KCL。

【技术特征摘要】
1.一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法，其特征在于，所用培养基的配方为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/LNaCl，0.002～0.003mol/LKCL。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所用培养基的配方为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.01mol/LNaCl，0.0025mol/LKCL。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，菌体的清洗和重悬均使用10％甘油。5.根据权利要求1～4任一所述方法，其特征在于，感受态细胞分装后即刻用液氮速冻，再进行保存。6.根据权利要求1～4任一所述方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获取菌株单菌落；(2)单菌落进行初培养；(3)再扩大培养至OD600nm在0.4～0.5之间；(4)步骤(3)所得菌液离心，沉淀用甘油清洗；(5)按照浓缩280～320倍的要求，用甘油重悬沉淀，分装后液氮速冻，超低温...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓诣群，张巧巧，邓凤如，文继开，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44