一种提高固氮微生物固氮能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高固氮微生物固氮能力的方法。所述方法是将表面活性剂添加到无氮液体或固体培养基中，得到表面活性剂无氮液体或固体培养基，然后将固氮微生物接种至表面活性剂无氮液体或固体培养基，对固氮微生物进行培养，收集得到固氮能力提高的固氮微生物；所述表面活性剂的添加量为无氮液体或固体培养基重量的0.0001—30％。通过本方法可以有效提高固氮微生物的固氮能力和菌种存活率，促进固氮微生物生长繁殖。本方法操作简单，便于实施，在提高农作物产量、降低化肥使用量、减少水土污染、保持农业可持续发展、降低能源消耗等方面发挥重要作用。

A Method to Improve Nitrogen Fixation Ability of Nitrogen Fixing Microorganisms

【技术实现步骤摘要】
一种提高固氮微生物固氮能力的方法
种提本专利技术属于生物固氮领域，具体涉及一种提高固氮微生物固氮能力的方法。
技术介绍
生物固氮是自然界生态系统中氮的主要来源，与工业固氮相比，它具有耗能低、效率高、无污染、分布广等优点。地球上结合态氮总量有70％来源于生物固氮，每年全球微生物固定的氮素量可达2亿吨，约占全球作物需氮量的3/4，相当于工业生产氮肥的3倍多。固氮微生物在农业可持续发展、环境保护和氮素平衡等方面具有重要作用。然而，固氮微生物在生产应用中普遍存在菌株的成活率较低、固氮活性不稳定性等问题，针对这些问题，目前主要采取低温保存和添加保护剂等方法，但是这些方法仍存在不足，固氮微生物菌体在保存2个月后，活菌死亡率超过80％以上，严重影响固氮微生物作为商品在农业生产中的应用。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术不足，提供一种提高固氮微生物固氮能力的方法。为了达到上述目的，本专利技术具体技术方案为：所述提高固氮微生物固氮能力的方法是将表面活性剂添加到无氮液体或固体培养基中，得到表面活性剂无氮液体或固体培养基，然后将固氮微生物接种至表面活性剂无氮液体或固体培养基，对固氮微生物进行培养，收集得到固氮能力提高的固氮微生物；所述表面活性剂的添加量为无氮液体或固体培养基重量的0.0001—30％。优选地，所述固氮微生物包括细菌、真菌和其他固氮微生物。更优选地，所述细菌为单一菌或复合菌；所述真菌为单一菌或复合菌。优选地，所述表面活性剂为生物表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂中的至少一种。优选地，所述固氮微生物的接种量为2—5％。优选地，所述方法具体包括如下步骤：(1)将表面活性剂添加在无氮液体或固体培养基中，使表面活性剂含量为0.0001—30％，即得表面活性剂无氮液体或固体培养基；(2)将固氮微生物接种至表面活性剂无氮液体培养基中，在20—40℃、100—300rpm转速条件下摇床培养过夜；或者，将固氮微生物接种至表面活性剂无氮固体培养基中，于25—35℃条件下培养72h；(3)收集经步骤(2)培养后的固氮微生物；(4)将收集的固氮微生物稀释在表面活性剂无氮液体培养基中，稀释至OD值为0.3—0.6，并检测，或直接将收集的固氮微生物接种至表面活性剂固体培养基中培养并检测。通过上述方法得到的固氮微生物便是固氮活性稳定，固氮能力提高的固氮微生物。采用本专利技术的方法，固氮微生物的固氮能力可提高12％以上，微生物存活率显著提高，且方法操作简单，便于实施。附图说明图1为实例1中非离子表面活性剂TritonX—100对固氮菌(AzotobacterHR1)固氮活性的影响；图2为实例2中生物表面活性剂鼠李糖脂对褐球固氮菌(AzotobacterchroococcumCICC20603)固氮活性的影响；图3为实例3中非离子表面活性剂TritonX—100对固氮菌(AzotobacterHR1)固氮稳定性的影响；图4为实例4中表面活性剂对固氮菌(AzotobacterHR1)生长的影响；图5为实例5中生物表面活性剂鼠李糖脂固体发酵培养对固氮菌(AzotobacterHR1)固氮活性的影响。具体实施方式实施例1所述提高固氮微生物固氮能力的方法包括如下步骤：(1)在无氮培养基中加入0.025％非离子表面活性剂TritonX—100，以2.0％接种量接种固氮菌(AzotobacterHR1)，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中过夜振荡培养。(2)离心或过滤收集步骤(1)过夜培养的菌体，将上述菌体稀释在含0.025％非离子表面活性剂TritonX—100的无氮培养基中(OD600＝0.3)。(3)向20mL血清瓶中加入5mL步骤(2)稀释的菌液，盖上胶塞，注入10％乙炔，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中振荡培养24h后，检测乙烯含量，计算固氮活性。在加入非离子表面活性剂TritonX—100处理下的固氮菌(AzotobacterHR1)的固氮活性，其中以不加任何表面活性剂处理的作为空白对照。结果见图1，非离子表面活性剂TritonX—100处理的固氮菌的固氮活性显著提高了17.9％。实施例2所述提高固氮微生物固氮能力的方法包括如下步骤：(1)在无氮培养基中加入25mg/L生物表面活性剂鼠李糖脂，以2.0％接种量接种褐球固氮菌(AzotobacterchroococcumCICC20603)，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中过夜振荡培养。(2)离心或过滤收集步骤(1)过夜培养的菌体，将上述菌体稀释在含25mg/L生物表面活性剂鼠李糖脂的无氮培养基中(OD600＝0.3)。(3)向20mL血清瓶中加入5mL步骤(2)稀释的菌液，盖上胶塞，注入10％乙炔，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中振荡培养24h后，检测乙烯含量，计算固氮活性。在加入生物表面活性剂鼠李糖脂处理下的褐球固氮菌(AzotobacterchroococcumCICC20603)的固氮活性，其中以不加任何表面活性剂处理的作为空白对照。结果见图2，生物表面活性剂鼠李糖脂处理的固氮菌的固氮活性显著提高了12.7％。实施例3所述提高固氮微生物固氮能力的方法包括如下步骤：(1)在无氮培养基中加入0.025％非离子表面活性剂TritonX—100，以2.0％接种量接种固氮菌(AzotobacterHR1)，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中过夜振荡培养。(2)离心或过滤收集步骤(1)过夜培养的菌体，将上述菌体稀释在含25mg/L生物表面活性剂鼠李糖脂的无氮培养基中(OD600＝0.3)。(3)向20mL血清瓶中加入5mL步骤(2)稀释的菌液，盖上胶塞，注入10％乙炔，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中振荡培养。(4)每隔8h取一次样，每次取样100uL，注入气相色谱中检测乙烯含量，并计算固氮活性。在加入非离子表面活性剂TritonX—100处理下的固氮菌(AzotobacterHR1)的固氮活性，其中以不加任何表面活性剂处理的作为空白对照。结果见图3，非离子表面活性剂TritonX—100处理后，随着培养时间的延伸固氮活性在不断增长，在24h后达到最大值，之后趋于稳定且整个过程中的固氮活性明显高于对照组。实施例4所述提高固氮微生物固氮能力的方法包括如下步骤：(1)在无氮培养基中接种固氮菌(AzotobacterHR1)，在温度为30℃和转速为160rpm的摇床中过夜振荡培养。(2)离心收集步骤(1)过夜培养的菌体，将上述菌体分别稀释在含0.025％非离子表面活性剂TritonX—100、0.025％阴离子表面活性剂SDS、25mg/L生物表面活性剂鼠李糖脂的无氮培养基中(OD600＝1.0)。(3)将步骤(2)稀释的菌体，分别取35uL接种量接种于生长曲线板中，再取163uL含对应表面活性剂的无氮培养基，在温度为30℃的生长曲线测定仪中振荡培养72h。在加入表面活性剂处理下的固氮菌(AzotobacterHR1)的生长曲线图，其中以不加任何表面活性剂处理的作为空白对照。结果见图4，表面活性剂处理后，固氮菌(AzotobacterHR1)的生长随着培养时间的延伸受到明显提高。实施例5所述提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高固氮微生物固氮能力的方法，其特征在于，所述方法是将表面活性剂添加到无氮液体或固体培养基中，得到表面活性剂无氮液体或固体培养基，然后将固氮微生物接种至表面活性剂无氮液体或固体培养基，对固氮微生物进行培养，收集得到固氮能力提高的固氮微生物；所述表面活性剂的添加量为无氮液体或固体培养基重量的0.0001—30％。

【技术特征摘要】
1.一种提高固氮微生物固氮能力的方法，其特征在于，所述方法是将表面活性剂添加到无氮液体或固体培养基中，得到表面活性剂无氮液体或固体培养基，然后将固氮微生物接种至表面活性剂无氮液体或固体培养基，对固氮微生物进行培养，收集得到固氮能力提高的固氮微生物；所述表面活性剂的添加量为无氮液体或固体培养基重量的0.0001—30％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固氮微生物为细菌或真菌。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌为单一菌或复合菌；所述真菌为单一菌或复合菌。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂包括生物表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：田云，李进，卢向阳，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43