一种荧光纳米探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光纳米探针及其制备方法，该荧光纳米探针由多糖配体、光敏剂和荧光纳米材料构成，将荧光纳米材料与多糖配体的水溶液混合后加入硼氢化钠溶液振荡反应，超滤离心除去未反应上的多糖配体，加入光敏剂溶液振荡反应，超滤离心除去未反应上的光敏剂分子，制得最终的荧光纳米探针。本发明专利技术方法制备得到的荧光纳米探针具有高灵敏性，可以检测出体内10

A fluorescent nanoprobe and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种荧光纳米探针及其制备方法
本专利技术属于荧光纳米探针
，涉及一种兼具广谱细菌检测和光动力治疗功能的荧光纳米探针及其制备方法。
技术介绍
世界卫生组织(WHO)于2018年发布了首个基本诊断清单(EDL)，强调了快速、灵敏、特异并且价格合理的诊断对于治疗由病毒、寄生虫和细菌引起的传染病至关重要(参见：Nat.Microbiol.3，847(2018))。据调查，每年有超过3亿人死于脓毒症、心内膜炎和其他由细菌引起的相关疾病(参见：Nat.Med.17，1142-1146(2011)；Nat.Med.10，S122-S129(2004)；Nat.Commun.9，917(2018))。所以目前急需研究出一种具有高特异性和灵敏性诊断体内病原菌并在感染初期清除这些病原菌的方法。虽然迄今为止已经开发出了多种用于细菌检测的方法，例如细菌培养、生物化学鉴定、免疫测定、聚合酶链反应(PCR)和测序等，但是这些方法大都耗时长且工序复杂(参见：Science314，1464-1467(2006)；Nat.Commun.5，5427(2014))。因此即使能通过这些方法成功诊断出病原菌感染，也可能已错过感染治疗的黄金时期，致使细菌感染愈发严重。荧光成像是一种简单、快速和灵敏的细菌检测方法。虽然目前已经研究出了大量可用于细菌检测诊断和治疗的荧光纳米探针，但是有些荧光纳米探针特异性欠佳，无法将细菌感染炎症同其他炎症疾病完全区别开来(参见：J.Am.Chem.Soc.132，12349-12356(2010))。并且已报道的荧光纳米探针大多都只能检测一种特定类型的细菌，革兰氏阳性或是革兰氏阴性菌(参见：Nat.Commun.9，1969(2018))，但是这两种类型的细菌都有可能造成临床细菌感染(如败血症、皮肤烧伤感染、未经消毒的器械感染等)，所以实现细菌的广谱检测非常重要。此外，目前已报道的荧光纳米探针的荧光通常都属于单激发、单发射，它们的单发射信号容易受局部探针浓度波动的影响，影响细菌成像检测的准确性(参见：ACSNano11，4428-4438(2017))。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有的荧光纳米探针特异性和灵敏性不高，且检测的细菌范围有限，无法实现广谱细菌检测的问题，提供一种兼具广谱细菌检测和光动力治疗功能的荧光纳米探针的制备方法，制得的荧光纳米探针在检测广谱细菌时具有高特异性以和高灵敏性。为实现上述目的，本专利技术将多糖配体与荧光纳米材料相连接，多糖配体可以通过细菌膜上的糖特异性转运通道进入细菌内部，但是无法进入膜表面不表达此通道的细胞，所以多糖配体可实现特异性细菌靶向检测。将光敏剂吸附至纳米材料表面，光敏剂不仅具有强荧光，还可在可见光光照下产生单线态氧杀死细菌。具体的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的荧光纳米探针的制备方法，包括下述步骤：步骤1、将荧光纳米材料和多糖配体溶液以4∶1～2∶1的浓度比混合，并于70℃振荡反应4～6小时后加入硼氢化钠溶液于室温下振荡反应过夜，制备得到稳定的多糖配体修饰的荧光纳米材料；所述的荧光纳米材料包括荧光硅纳米颗粒、复合荧光二氧化硅纳米颗粒、II-IV族量子点、荧光纳米微球、碳点等。所述的多糖配体包括麦芽糖糊精、直链淀粉、葡萄糖聚合物等。步骤2、通过超滤离心除去步骤1中未反应上的多糖配体以纯化多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物；优选的，所述的超滤离心条件为7500rpm/min下离心处理15min。步骤3、向步骤2制备得到的纯化的多糖配体偶联荧光纳米材料复合物的溶液中加入光敏剂溶液于室温下振荡反应12～16小时；所述的光敏剂包括二氢卟吩e6(Ce6)，亚甲基兰、亚甲苯兰以及血卟啉衍生物等。步骤4、将步骤3制得的混合物通过超滤离心以除去未反应上的光敏剂分子，得到目标产物；优选的，所述的超滤离心条件为7000rpm/min下离心处理10min。理论上，一方面在小尺寸的荧光纳米材料上连接上靶向细菌的多糖配体后，多糖配体就会引导整个纳米探针体系通过细菌细胞膜上的特异性转运通道进入细菌内部，实现整个纳米探针体系的特异性细菌荧光成像功能；另一方面，纳米探针所负载的光敏剂在可见光照射下产生单线态氧具有杀死细菌的作用。本专利技术所构建的荧光纳米探针主要由三种成分组成：靶向细菌的多糖配体小分子、具有光响应治疗作用的光敏剂小分子以及起载药和成像作用的荧光纳米材料颗粒。其中多糖配体小分子以共价键方式连接在荧光纳米颗粒表面，另一方面，光敏剂小分子通过静电作用吸附到荧光纳米材料表面。本专利技术选取多糖分子为细菌靶向性分子，克服了目前大多数细菌检测荧光纳米探针只能检测一种类型细菌(革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌)的局限，实现了广谱细菌检测。同时，多糖分子可以带领整个荧光纳米探针通过细菌膜上的糖特异性转运通道进入细菌内部，而这种通道在哺乳动物细胞膜上不会表达，这就造就了此探针细菌检测的高特异性。本专利技术制备得到的荧光纳米探针可以检测出体内105CFU数量的细菌，体现了此探针体内细菌检测的高灵敏性。制备的荧光纳米探针不仅可以检测细菌还可通过其上负载的光敏剂分子实现光动力细菌感染治疗。此外，此荧光纳米探针不仅有良好的荧光稳定性，还具备优异的生物安全性，有望用于临床细菌感染检测与治疗。附图说明图1是本专利技术荧光纳米探针的制备方法及作用机理图；图2是本专利技术荧光纳米探针用于体外广谱细菌成像检测，四种不同类细菌(EC：大肠杆菌，SA：金黄色葡萄球菌，ML：藤黄微球菌，PA：绿脓杆菌)分别和GP-Ce6-SiNPs孵育后的激光共聚焦荧光成像图；图3是本专利技术荧光纳米探针用于体内广谱细菌感染成像检测，其中，a为对感染PA(绿脓杆菌1×107CFU，左)和SA(金黄色葡萄球菌1×107CFU，右)的老鼠尾静脉注射GP-Ce6-SiNPs后成像以及相应的荧光强度柱状图；b为对感染PA和SA混合菌(1×107CFU)的老鼠尾静脉注射GP-Ce6-SiNPs后成像以及相应的荧光强度柱状图，以PBS为实验对照组；c为对感染PA或者SA(1×105CFU)的老鼠尾静脉注射GP-Ce6-SiNPs后成像以及相应的荧光强度柱状图，以PBS为实验对照组；图4是本专利技术荧光纳米探针用于体外广谱细菌光动力治疗的分析数据，其中，a为EC(大肠杆菌)和SA(金黄色葡萄球菌)和GP-Ce6-SiNPs孵育后光照(660nm，12mW/cm2)前后的扫描电镜(SEM)图像以及活死细菌染色荧光成像图；b是图a中活死细菌染色图中的活细菌定量结果；将未处理的EC(大肠杆菌)和SA(金黄色葡萄球菌)以及和GP-Ce6-SiNPs孵育过的EC(大肠杆菌)和SA(金黄色葡萄球菌)分别置于660nm光照下照射0，5，10和15分钟后的细菌平板培养结果(c)，菌液浑浊度(d)和细菌CFU计数结果(e)；图5是本专利技术荧光纳米探针用于体内广谱细菌感染光动力治疗的分析数据，其中，a为对SA(金黄色葡萄球菌)和PA(绿脓杆菌)感染的老鼠分别尾静脉注射GP-Ce6-SiNPs和PBS，并分别选择其中一组进行光照(660nm，12mW/cm2)40分钟，每天对伤口进行拍照记录；b为对应a图老鼠的相对感染面积大小(S/S0)；分别取处理第7天SA感染的老鼠伤口皮肤和第9天PA感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括下述步骤；S1、将荧光纳米材料和多糖配体溶液以4∶1～2∶1的浓度比混合，并于70℃振荡反应4～6小时后加入硼氢化钠溶液于室温下振荡反应过夜，制备得到多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物；S2、超滤离心除去S1中未反应上的多糖配体，得纯化的多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物；S3、向S2纯化的多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物溶液中加入光敏剂溶液于室温下振荡反应12～16小时；S4、将S3制得的混合物通过超滤离心以除去未反应上的光敏剂分子，得到目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括下述步骤；S1、将荧光纳米材料和多糖配体溶液以4∶1～2∶1的浓度比混合，并于70℃振荡反应4～6小时后加入硼氢化钠溶液于室温下振荡反应过夜，制备得到多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物；S2、超滤离心除去S1中未反应上的多糖配体，得纯化的多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物；S3、向S2纯化的多糖配体偶联荧光纳米材料的复合物溶液中加入光敏剂溶液于室温下振荡反应12～16小时；S4、将S3制得的混合物通过超滤离心以除去未反应上的光敏剂分子，得到目标产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光纳米材料为荧光硅基纳米颗粒、复合...

【专利技术属性】
技术研发人员：何耀，汤加丽，王后禹，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32