一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及天然产物的分离提纯技术领域，具体涉及一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：A、双水相体系萃取蛋白质：将低共熔溶剂和含有蛋白质的无机盐水溶液混合均匀，然后离心得到液‑液两相体系，收集下相萃取液；B、反萃取蛋白质：将步骤A中的下相萃取液用水稀释后离心得到液‑固两相体系；C、蛋白质纯品制备：将步骤B中的固相用水溶解，并进行超滤离心后冷冻干燥，即得蛋白质纯品；其中，所述步骤A中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。本发明专利技术采用基于HFIP的DES‑盐双水相体系，DES相易于收集，对蛋白质的萃取率和反萃取率高，蛋白质纯度高，蛋白质结构和活性均得到保持；操作简便。

A Method for Separation and Purification of Protein in Aqueous Two-phase System

【技术实现步骤摘要】
一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法
本专利技术涉及天然产物的分离提纯
，具体涉及一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法。
技术介绍
蛋白质是生命活动的物质基础，其分离和纯化已引起越来越多的关注。传统的蛋白质纯化方法包括硫酸铵沉淀，离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤层析等，存在操作繁琐、耗时长、成本高等问题。因此，开发快速简单有效的蛋白质纯化技术至关重要。双水相体系(ATPS)是一种或几种物质的水溶液在一定条件下自发形成的两个互不相溶、界面清晰的水相体系，基于分析物在两相中的选择性分配实现分离。由于操作简便且易于放大、分相条件温和、生物相容性好、分离效率高等特点，双水相体系在天然产物的分离纯化领域有着诸多应用。低共熔溶剂(DES)是通过将氢键受体(HBA，如季铵盐)和氢键供体(HBD，如酰胺，羧酸和醇)以一定的摩尔比混合制备得到的均一液体。DES不仅具有良好的蛋白质溶解度，而且还有助于蛋白质在水溶液中的热稳定性，构象稳定性和生物活性。DES-无机盐双水相体系是一种新型双水相体系，与传统的双水相体系相比，具有分相迅速、粘度低、萃取过程不易乳化等优点。但是DES-无机盐双水相体系应用于分离纯化蛋白质时存在一些问题：(1)萃取后难以从DES相中进一步分离纯化蛋白质，蛋白质的反萃取效率较低，尽管蛋白质和DES可通过透析分离，但速度慢，耗水量大；(2)DES分相能力较弱，需较高的盐浓度才能形成双水相体系；(3)离心后DES相位于上层，不方便收集。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，利用水稀释低共熔溶剂萃取相进行蛋白质的反萃取，反萃取操作简单，获得了高纯度的蛋白质。本专利技术实现以上目的采用的技术方案是：一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，包括以下步骤：A、双水相体系萃取蛋白质：A1、取待分离纯化蛋白质的样品，用无机盐水溶液溶解或稀释，混匀得到混合溶液；A2、将低共熔溶剂和步骤A1中的混合溶液混合均匀，然后离心得到液-液两相体系，收集下相萃取液；B、反萃取蛋白质：B1、将步骤A2中的下相萃取液用水稀释，混合均匀后离心得到液-固两相体系；C、蛋白质纯品制备：C1、将步骤B1中的固相用水溶解，并进行超滤离心，除去残留的低共熔溶剂组分和无机盐，得到蛋白质溶液；C2、将步骤C1中的蛋白质溶液冷冻干燥，即得蛋白质纯品；其中，所述步骤A2中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。本专利技术利用基于HFIP(六氟异丙醇)的DES(低共熔溶剂)-无机盐双水相体系萃取蛋白质，并且首次利用水稀释DES相的方法进行蛋白质的反萃取。HFIP具有低沸点(59℃)、高密度(1.596g/mL)、强溶解能力、强氢键给体能力(1.96，异丙醇0.767)、强疏水性(logP＝1.57,异丙醇0.173)等独特性能。这些特性使得基于HFIP的DES-无机盐双水相体系较传统的DES-无机盐双水相体系具有以下优势：(1)分相能力更强HFIP具有强氢键给体能力，可以和多种氢键受体合成DES，因此可供选择的DES种类更多。HFIP的高密度使得分相后DES相位于下层，方便收集。除盐析作用外，HFIP的强疏水性、HFIP分子间的强氢键作用在体系分相中也发挥了一定的作用。因此，基于HFIP的DES分相能力显著强于传统的DES。(2)萃取效率高，反萃取操作简单，反萃取效率更高HFIP具有优异的溶解能力，基于HFIP的DES具有良好的蛋白质溶解度。基于HFIP的DES-无机盐双水相体系可以为目标蛋白质提供多种作用力，包括氢键相互作用，疏水相互作用，盐析效应等，有利于提高萃取效率。传统的DES-无机盐双水相体系，通过向DES相中加入无机盐水溶液，调节pH等方法进行反萃取，但是反萃取效率低，也不能实现蛋白质的纯化。水稀释DES相的方法，是因为大量水的加入破坏了DES相的结构，使蛋白质释放出来，通过简单的涡旋，离心操作即可完成反萃取过程，实现蛋白质的纯化，且反萃取效率较高。(3)纯化效果好，蛋白质的结构和生物活性得到保持DES有助于蛋白质在水溶液中的热稳定性，构象稳定性和蛋白质活性。大量水稀释DES相破坏DES结构后，蛋白质基本处于水环境，结构和活性均得到保持。再通过简单的超滤离心，冷冻干燥即可得到纯度更高的蛋白质。本专利技术的方法采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，DES相易于收集，DES相对蛋白质的萃取率高；所得的DES相只需通过简单的操作即可完成反萃取和纯化过程，反萃取效率高，可获得高纯度的蛋白质；蛋白质结构和活性均得到保持；分离纯化蛋白质的方法操作简便，成本低廉，适合工业化生产。优选地，所述步骤A1中，待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品或含蛋白质的生物样品。本专利技术中的蛋白质标准品一般为固体状，采用无机盐水溶液进行溶解，含蛋白质的生物样品一般为血清、蛋清等液体状，采用无机盐水溶液进行稀释。优选地，所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品时，混合溶液中蛋白质的浓度为2.5-15mg/mL。优选地，所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为含蛋白质的生物样品时，生物样品与无机盐水溶液的体积比范围为1:10-100。优选地，所述步骤A中，无机盐为硫酸钠、磷酸氢二钾中的至少一种，无机盐水溶液的pH为7-10，所述步骤A2中，液-液两相体系中，无机盐的质量百分比为0.8％-6.04％。无机盐的种类保证了本专利技术的方法中反萃取过程的成功完成，若选用其他无机盐，下相萃取液加水稀释不会有富含蛋白质的固体沉淀，反萃取过程不能顺利进行。无机盐水溶液的pH保证了在所采用的无机盐用量下本专利技术的液-液体系的成功形成。本专利技术通过控制无机盐的种类、浓度和pH保证了本专利技术的步骤A和步骤B的成功，使萃取和反萃取过程顺利完成。优选地，所述步骤A2中，低共熔溶剂为季铵盐和六氟异丙醇按照摩尔比为1:1.5-2.5配制而成，液-液两相体系中，低共熔溶剂的质量百分比为19.53％-54.82％。-优选地，所述季铵盐为氯化胆碱和/或四甲基氯化铵。优选地，所述步骤B1中，下相萃取液与水的体积比为1:7.5-12。下相萃取液与水的体积比保证了本专利技术的方法中反萃取过程的成功和高效完成。稀释倍数较小时，下相萃取液加水稀释不会有富含蛋白质的固体沉淀，稀释倍数较大时，大量的水则会溶解部分蛋白质，导致反萃取率的降低。本专利技术通过控制下相萃取液与水的体积比为1:7.5-12，控制较高的蛋白质反萃取率。优选地，所述步骤C1中，超滤离心截留分子量≥3KD的物质。优选地，所述步骤A2中，采用振荡或者涡旋将低共熔溶剂和混合溶液混匀，其中，振荡速率为500-1500rpm，振荡时间为0-30min，振荡温度为15-55℃；涡旋功率为60W，涡旋时间为0-30min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min，所述步骤B1中，采用涡旋将下相萃取液和水混匀，其中，涡旋功率为60W，涡旋时间为1-15min；离心转速为2000-6000rpm，离心时间为3-15min。本专利技术的有益效果为：1.采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，DES相易于收集，DES相对蛋白质的萃取率高，牛血清白蛋白萃取率为99.20％-100.00％；2.采用基于HFIP的DES-盐双水相体系，所得的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、双水相体系萃取蛋白质：A1、取待分离纯化蛋白质的样品，用无机盐水溶液溶解或稀释，混匀得到混合溶液；A2、将低共熔溶剂和步骤A1中的混合溶液混合均匀，然后离心得到液‑液两相体系，收集下相萃取液；B、反萃取蛋白质：B1、将步骤A2中的下相萃取液用水稀释，混合均匀后离心得到液‑固两相体系；C、蛋白质纯品制备：C1、将步骤B1中的固相用水溶解，并进行超滤离心，除去残留的低共熔溶剂组分和无机盐，得到蛋白质溶液；C2、将步骤C1中的蛋白质溶液冷冻干燥，即得蛋白质纯品；其中，所述步骤A2中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。

【技术特征摘要】
1.一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、双水相体系萃取蛋白质：A1、取待分离纯化蛋白质的样品，用无机盐水溶液溶解或稀释，混匀得到混合溶液；A2、将低共熔溶剂和步骤A1中的混合溶液混合均匀，然后离心得到液-液两相体系，收集下相萃取液；B、反萃取蛋白质：B1、将步骤A2中的下相萃取液用水稀释，混合均匀后离心得到液-固两相体系；C、蛋白质纯品制备：C1、将步骤B1中的固相用水溶解，并进行超滤离心，除去残留的低共熔溶剂组分和无机盐，得到蛋白质溶液；C2、将步骤C1中的蛋白质溶液冷冻干燥，即得蛋白质纯品；其中，所述步骤A2中，低共熔溶剂由季铵盐和六氟异丙醇配制而成。2.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品或含蛋白质的生物样品。3.根据权利要求2所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为蛋白质标准品时，混合溶液中蛋白质的浓度为2.5-15mg/mL。4.根据权利要求2所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A1中，当待分离纯化蛋白质的样品为含蛋白质的生物样品时，生物样品与无机盐水溶液的体积比范围为1:10-100。5.根据权利要求1所述的双水相体系分离纯化蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤A中，无机盐为硫酸钠、...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖玉秀，王璇璇，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42