TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术和医学诊断领域，具体是转化生长因子β激活激酶1(TAK1)在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。本发明专利技术还提供TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。本发明专利技术研究发现TAK1能够特异性负向调控食管鳞癌细胞株ECA109细胞的增殖、迁移和侵袭，食管癌患者肿瘤组织中TAK1表达水平明显低于癌旁正常组织。由此本发明专利技术进一步提供了TAK1在食管癌患者预后评估中的应用。本发明专利技术提供了TAK1在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，以及相应的检测试剂盒。

Application of TAK1 protein in preparation of prognostic assessment kit or kit for esophageal cancer

【技术实现步骤摘要】
TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用
本专利技术涉及生物技术和医学诊断领域，具体地说，是转化生长因子β激活激酶1(TGF-βactivatedproteinkinase1，TAK1或称MAP3K7、MAPKKK)在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
技术介绍
食管癌是世界上最常见的八大恶性肿瘤之一。在全球范围内，其发病率排名第八位，死亡率排名第六位，严重威胁着人类健康。全世界每年新增食管癌患者约45万人，每年大约有20万人死于食管癌。我国是食管癌的高发地区，其发病率和死亡率均位于世界之首。根据WHO的统计，全世界每年因食管癌死亡的患者中，约有一半是中国人，我国每年约有15万人死于食管癌。食管癌的病理类型主要包括食管鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、燕麦小细胞癌等，其中95％以上的为鳞状细胞癌。我国食管癌患者主要表现为食管鳞状细胞癌(ESCC)。食管癌很难早期发现，病程进展迅速，预后较差，治疗以手术、化疗、放疗相结合的方式为主，5年生存率仅为15％～25％。到目前为止，对于食管鳞癌的治疗仍无突破性进展，因此，食管癌的早期诊断和治疗成为急救医学的研究热点之一。为了更加有效地治疗和预防食管癌，研究者越来越关注食管癌的早期诊断、治疗及病情发展预判。目前，发现可评估食管癌患者预后的生物标记物是亟需解决的问题。本领域迫切需要发现在食管癌中能预测术后患者疗效的生物标志物，这方面的研究对临床治疗食管癌具有重要意义。转化生长因子β激活激酶1(TGF-βactivatedproteinkinase1，TAK1或称MAP3K7、MAPKKK)是细胞内的分子中心，1995年最先由Matsumoto及其同事在酵母双杂交实验中发现的色氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于MAP3K家族成员之一。TAK1调控着NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号通路，在细胞生存，免疫应答，新陈代谢和致癌中起到关键作用。现有的研究表明TAK1在肿瘤的发生、发展和转移过程中作为一个肿瘤促进子或肿瘤抑制子发挥着重要的作用。该基因由17个外显子和16个内含子构成，在生物信息传递过程中可形成4个在组织中分布存在显著差异的剪接体，其表达的蛋白由606个氨基酸构成，分子量为67kD；其N末端为经典的激酶结构域。TAK1发挥活性需要通过TGF-β受体信号通路、IL-1受体通路、Toll样受体(TLR)信号通路、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNFR1信号通路和B细胞受体(BCR)信号通路激活；首先TAK1需要被募集并和其连接蛋白TAB1、TAB2、TAB3结合形成聚泛素链---TAK1-TAB1/TAB2/TAB3复合体；然后再根据不同的结合蛋白激活下游的信号通路，其次TAK1的激活需要有Thr184和Thr187在其激活环内磷酸化，突变了的Thr184和Thr187残留物能降低TAK1激酶的活性，此种情况提示这些残留物的自动磷酸化对于TAK1的激活来说是必需的。在有机体内，TAK1的激活受到TAB1，TAB2和TAB3的调控，它们各自对调控的贡献是复杂的，依赖于组织的类型和细胞所处的外部环境。研究发现，当TAK1被敲除或是通过特异性抑制剂阻滞其生物学功能时，TAK1的激活能够抑制caspase-8与caspase-3的激活，凋亡蛋白酶的失活从而阻止了凋亡细胞的死亡。TAK1抑制caspase的激活主要的机制：TAK1-NF-κB途径。现在已明确TAK1是NF-κB上游的激酶，NF-κB转录上调抗凋亡蛋白如c-FLIP和IAP家族蛋白而IAP家族包括cIAP1，cIAP2和XIAP，能够抑制caspase激活。当TAK1缺失时，细胞对数种应激导致的细胞凋亡变得敏感；激活的TAK1可通过NF-κB途径和MAPK途径促进细胞的生存，因此，TAK1在有机体内有促进生存的作用，当其表达异常时可能会引起机体细胞对各种生物因子导致的细胞死亡变得敏感。现有的资料表明，TAK1的异常表达几乎在人类所有系统的肿瘤中都能发现。在食管癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌等等不同的恶性肿瘤中呈现出异常表达，并与恶性肿瘤的发生发展及其预后有着密切的关系。尽管如此，该基因在食管癌生物学行为中的作用国内外却未见研究，目前为止，TAK1在食管癌中的研究尚无文献报道，其在食管癌发生、发展中的分子机制仍不清楚。目前还未见TAK1蛋白在制备食管癌术后疗效评估试剂及试剂盒中应用的研究报道。而本领域迫切需要寻找到可有效用于食管癌治疗、诊断和预后评估分子，并将其用于这些用途中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供TAK1蛋白的新应用，特别是在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。本专利技术还提供TAK1蛋白在制备治疗食管癌的药物中的应用。本专利技术的第一方面，提供TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在食管癌患者术后食管癌组织中的表达量，基于TAK1蛋白的表达量与食管癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测可以作为评估食管癌病人预后的指标。进一步的，所述的试剂或试剂盒检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。进一步的，食管癌组织或者原发灶穿刺组织中TAK1高表达的食管癌病人预后更好，生存期长，复发率低，TAK1低表达的食管癌病人预后不佳。进一步的，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。更进一步的，所述的试剂或试剂盒是将TAK1蛋白作为分子标记，利用TAK1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量，预测食管癌患者预后情况。所述的TAK1单克隆抗体，为商品化抗体，如兔TAK1单克隆抗体(ab109526)。进一步的，所述的免疫组化试剂包括二甲苯，乙醇，3％H2O2溶液，1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。本专利技术的第二方面，提供一种评估食管癌患者预后的方法，所述的方法为检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。进一步的，所述的检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量的方法，包括以下步骤：(a)利用免疫组化试剂二甲苯，乙醇，3％H2O2溶液，1％BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将食管癌组织切片进行免疫组化染色；(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；(c)根据免疫组化染色结果人工评分原则，给出评分。优选的，所述的方法具体步骤如下：(1)制备食管癌组织石蜡切片，60℃烤箱4h；(2)切片脱腊至水；(二甲苯Ⅰ①10min→二甲苯Ⅱ②10min→二甲苯Ⅲ③10min→100％乙醇①5min→100％乙醇②5min→95％乙醇①5min→95％乙醇②5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→0.01MPBS洗5min)(3)抗原修复：切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸20min；(4)自然冷却至室温，0.01MPBS洗10min×3；(5)3％H2O2溶液，室温放置20min；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。3.根据权利要求2所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。4.根据权利要求3所述的TAK1蛋白在制备食管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒是将TAK1蛋白作为分子标记，利用TAK1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析TAK1蛋白在术后食管癌组织或者原发灶穿刺组织中的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠前前，史辉，孙诚，蒋茂荣，柏婷，袁俊，黄文欣，柏文，王佩文，方慧晶，
申请(专利权)人：南京恒健文化传播有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32