一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法技术

本发明专利技术提供了一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法。本发明专利技术的方法，包括如下步骤：a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4‑丁二醇二甲磺酸酯。本发明专利技术的方法对牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好，同时牙鲆的存活率高达85％以上。

A Method of Promoting Apoptosis of Germ Cells in the Testes of Paralichthys olivaceus

【技术实现步骤摘要】
一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法
本专利技术涉及生殖细胞移植
，具体涉及一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法。
技术介绍
近年来，生殖细胞移植(GermcelltransplantationGCT)这一新兴生物技术的应用越来越广泛，而选择适宜的受体能够大大加快性别选择育种的进程。作为生殖细胞移植受体的前提条件是其生殖腺自身生殖细胞凋亡并且能够支持供体的生殖细胞发育和增殖。自Brinster等人在啮齿目动物建立了生殖细胞移植体系以来，已在羊、牛、猪、猴等动物实验中获得成功。在上述动物的生殖细胞移植实验中，通常采用化疗药物处理、放射线照射处理或者高温处理方式进行。目前，在鱼类生殖细胞移植实验中，受体制备方法包括针对虹鳟的二倍体、三倍体法，针对斑马鱼、金鱼的吗啉反义寡核苷酸注射法等。然而，上述方式均无法适用于牙鲆成鱼，即：无法在保证牙鲆存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，该方法对牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好，牙鲆的存活率高。本专利技术提供的促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，包括如下步骤：a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯(即白消安)。目前，有少量针对罗非鱼等成鱼的高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法的相关报道。例如，针对罗非鱼的性腺枯竭实验是在26℃左右的高温培育条件下直接以40mg/kg/BW左右的剂量腹腔注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯4次，高温培育时间为56天左右，即在高温开始时进行第一次注射，间隔14天注射1次，连续注射4次后继续高温培育14天左右。本专利技术人采用现有性腺枯竭实验中的高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法进行了大量的试验，研究发现即便调整或优化现有高温培育的温度、时间以及1,4-丁二醇二甲磺酸酯的注射次数、剂量等均无法在获得针对牙鲆精巢生殖细胞良好凋亡效果的同时保证牙鲆的存活率。例如，对经过了生殖期(即非生殖期)的3龄牙鲆雄鱼进行4次注射，结果发现死亡率高达56％左右；又如，对生殖期的3龄牙鲆雄鱼进行2次注射，结果发现即便在较低剂量下注射，然而注射1-2次牙鲆雄鱼几乎全部死亡。本专利技术人经大量研究发现，现有高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法无法适用于牙鲆雄鱼的原因可能在于，现有方式均是针对非生殖期雄鱼或者是在精液存在的情况下对雄鱼进行性腺枯竭实验。研究发现：在精液存在的情况下，注射较低剂量的1,4-丁二醇二甲磺酸酯会导致大量的精子同时凋亡而不能短时间排泄，从而无法在保证存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。鉴于上述发现，从而完成了本专利技术。本专利技术促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，在性腺枯竭实验之前先在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，以使牙鲆的精液完全消化；此时，在随后进行的性腺枯竭实验体系中不存在精液，即：精液不会对后续在第二温度下进行的第二次培育及1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射处理产生不利影响，该方式能够在保证存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。本专利技术对第一次培育的条件不作严格限制，只要能够使牙鲆的精液完全消化即可。在本专利技术中，“精液完全消化”指的是通过人工挤压已肉眼看不出精液排出；此外，可以通过组织切片等常规方式检测精液是否完全消化。具体地，所述第一高温为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；此外，可以控制第一次培育的时间为45-75天，优选为55-65天，更优选为60天。在上述温度和时间下进行第一次培育，能够使牙鲆的精液完全消化，同时不会对牙鲆的存活造成不利影响。研究发现，第一次培育的温度不宜过高或过低，温度过低(例如低于25℃)无法保证规定时间内牙鲆精巢精子的凋亡效果，而温度过高(例如高于29℃)导致牙鲆存活率显著降低；此外，第一次培育的时间不宜过长或过短，时间过短(例如低于45天)无法使牙鲆的精液完全消化，从而影响牙鲆精巢生殖细胞的凋亡，而时间过长(例如高于75天)会显著降低牙鲆的存活率。在本专利技术中，可以理解，第一次培育至牙鲆的精液完全消化后，即可进行后续的第二次培育，以避免对牙鲆的存活率造成不利影响。进一步地，本专利技术的促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，在所述第一次培育之前还包括：将正常养殖温度梯度升温至所述第一高温；其中，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天。此外，对正常养殖温度不作严格限制，可以为适合牙鲆生长的温度，正常养殖温度例如可以为7-16℃，优选为10-14℃。梯度升温有利于牙鲆对温度进行逐渐适应，进而有利于保证牙鲆的存活率。在本专利技术中，步骤b)为针对牙鲆精巢生殖细胞凋亡的性腺枯竭实验；具体地，通过在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，同时在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯，以诱导并促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡。在本专利技术中，所述第二高温为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；特别是，所述第二高温可以与所述第一高温相同或相近。此外，可以控制所述第二次培育的时间为24-32天，优选为27-32天，更优选为28天。进一步地，所述注射可以分两次进行，每次注射的剂量可以为15-25mg/kg/BW，优选为15-18mg/kg/BW。在本专利技术中，注射剂量15-25mg/kg/BW指的是对牙鲆每1kg体重注射15-25mg1,4-丁二醇二甲磺酸酯。上述特定的第二次培育和注射条件基本不影响牙鲆的存活率，同时对牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好。进一步地，可以控制两次注射的间隔时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天；此外，可以控制第二次注射后继续进行的第二次培育的时间为12-16天，优选为13-15天，更优选为14天。更具体地，步骤b)可以包括如下顺序进行的步骤：对经所述第一次培育的牙鲆第一次注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯，随后在第二高温下继续第二次培育12-16天；再对牙鲆第二次注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯，随后在第二高温下继续第二次培育12-16天。在上述条件下，牙鲆精巢所有精小囊内各级生殖细胞几乎全部凋亡，性腺指数大幅降低，同时vasa基因表达量也显著降低，牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好；特别是，牙鲆的存活率能够达到85％以上，在实现牙鲆精巢生殖细胞良好凋亡效果的同时保证了牙鲆的存活率。在本专利技术中，所述注射采用生殖孔注射方式进行。研究发现，采用生殖孔注射方式既大大降低了1,4-丁二醇二甲磺酸酯的注射剂量，同时提高了牙鲆的存活率，其原因在于该注射方式能够使1,4-丁二醇二甲磺酸酯直接作用于牙鲆的靶器官性腺。在本专利技术中，牙鲆优选为≥2龄的牙鲆，更优选为2-6龄的牙鲆。其中，牙鲆的培育水温可以为7-29℃，适宜的培育水温为18-22℃。研究发现，该年龄阶段的成熟牙鲆雄鱼作为受体最为合适，年龄太小(例如1龄以内)的牙鲆不易通过生殖孔注射方式将1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射到性腺中，而年龄太大的牙鲆耐高温性能差，容易死亡。本专利技术提供的促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，在性腺枯竭实验之前先对生殖期的牙鲆进行第一高温下的第一次培育，从而使牙鲆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4‑丁二醇二甲磺酸酯。

【技术特征摘要】
1.一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一高温为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃；所述第二高温为25-29℃，优选为27.5-28.5℃，更优选为28℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，控制所述第一次培育的时间为45-75天，优选为55-65天，更优选为60天。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，控制所述第二次培育的时间为24-32天，优选为27-32天，更优选为28天。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述第一次培育之前还包括：将正常养殖温度梯度升温至所述第一高温；其中，所述梯度升温的速率为1-2℃/天，优选为1℃/天；优选地，所述正常养殖温度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：任玉芹，王玉芬，于清海，孙朝徽，侯吉伦，张晓彦，王桂兴，姜秀凤，司飞，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院北戴河中心实验站，
类型：发明
国别省市：河北,13