水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3;3的应用制造技术

本发明专利技术公开了水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用。一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3，Genbank中的登录号为AB710141。该基因可在减少水稻中柱部分三价As的浓度，减少三价As向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。本发明专利技术通过大量实验发现了水稻中的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的生物功能，该基因超表达后，降低了水稻地上部的As含量。超表达该基因显著降低水稻叶片、种壳和籽粒中As的积累。

Application of Rice Aquaporin Coding Gene OsNIP3; 3

【技术实现步骤摘要】
水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用
本专利技术属于基因工程
，涉及水稻水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的应用。
技术介绍
目前，环境中的重金属污染问题日益突出，其中耕地土壤砷(As)污染也日趋严重。水稻是重要的粮食作物，全球一半左右的人口以水稻为主要粮食作物。由于水稻对砷的富集，稻米占我国人口膳食砷摄入的60％(Lietal.2009)。因此解析水稻对As的吸收解毒机制以及通过基因工程技术开发降低水稻籽粒对As的积累的方法十分重要。在土壤中，砷在好氧条件与淹水条件分别以五价砷As(V)和三价砷As(III)的形态存在(Zhaoetal.,2010)。As(III)主要通过水通道蛋白Lsi1被水稻根部吸收(Maetal.,2008)，在植物体内，As(III)可以被植物螯合肽(PCs)螯合并被转运到液泡中(Haetal.,1999；Raabetal.,2005；Liuetal.,2010)或者直接被排出体外进行解毒。而As(V)主要通过磷酸盐转运蛋白被水稻吸收(Wangetal.,2016；Wuetal.,2011；Kamiyaetal.,2013)。吸收到植物体内的As(V)会被硫氰酸酶家族基因还原成As(III)(Chaoetal.,2014；Sanchez-Bermejoetal.,2014；Shietal.,2016；Xuetal.,2017)，进而被螯合或者排出体外进行解毒。在许多植物中发现砷主要以As(III)的形态存在，因此水稻体内As(III)的运输过程十分重要。植物水通道蛋白(NIPs)不仅可以高效转运水分子,还可作为一种离子选择性透过膜有效介导其他小分子物质、营养元素以及金属离子的运输。小麦和拟南芥的水通道蛋白能通透NH4+/NH3-(Holmetal.,2005)；西葫芦的水通道蛋白NIP1能够转运尿素(Klebletal.,2003)；一些NIPs除了通透水外，拟南芥AtNIP5；1和AtNIP6；1,水稻OsNIP2；1(Lsi1)还可双向转运亚砷酸盐(Maetal.,2008；Bienertetal.,2008)。目前在水稻中参与体内As(III)运输的水通道蛋白基因除Lsi1外很少被报道。OsNIP3；3基因在Genbank中的登录号为AB710141。本专利技术OsNIP3；3基因在Genbank中被注释为类NOD26的水通道蛋白(NOD26-likeintrinsicprotein)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻水通道蛋白编码基因。本专利技术的目的是提供该基因的应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3，Genbank中的登录号为AB710141。所述的水通道蛋白编码基因的超表达载体，含有所述的水通道蛋白编码基因。所述的超表达载体，优选以pTCK303载体为出发载体，将所述的水通道蛋白编码基因的开放阅读框序列插入SpeI及KpnI酶切位点间所得。所述的水通道蛋白编码基因在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。所述的应用优选将所述的水通道蛋白编码基因构建超表达载体，并导入水稻得到超表达该基因的水稻，从而减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。所述的水通道蛋白编码基因在降低砷污染水稻土中水稻籽粒砷含量中的应用。本专利技术所述的超表达载体在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。所述的应用，将所述超表达载体导入水稻得到超表达该水通道蛋白编码基因的水稻，在减少水稻根中三价砷向木质部装载，和显著降低水稻地上部与籽粒砷的积累中的应用。本专利技术所述的超表达载体在降低砷污染水稻土中水稻籽粒砷含量中的应用。本专利技术的有益效果1、本专利技术通过系统研究，首次提供了一种水通道蛋白编码基因OsNIP3；3及其生物学功能。2、该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在非洲爪蟾卵母细胞中异源表达后，证明了其对As(III)的运输能力(图1)。3、构建了OsNIP3；3超表达材料(图2)3、该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3超表达后，减少了水稻地上部和木质部汁液里面的As含量(图3，图4)。4、超表达该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3显著降低水稻叶片和种壳中砷的积累(图5)。5、超表达该水通道蛋白编码基因OsNIP3；3显著降低水稻籽粒中砷的积累(图6)。附图说明图1为OsNIP3；3在蛙卵细胞中异源表达后，证明了其对As(III)的运输能力。其中，H2O代表注射水的蛙卵细胞，为负对照，Lsi1表示注射Lsi1的cRNA的蛙卵细胞，为正对照。NIP3；3表示注射OsNIP3；3的cRNA的蛙卵细胞。OsNIP3；1表示注射OsNIP3；1的cRNA的蛙卵细胞，为弱功能对照。图2为OsNIP3；3在超表达材料和野生型中表达量。图3为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，根部As含量没有明显变化，但是地上部As含量明显减少。外界5μMAs(III)处理24h后超表达材料与野生型中根部和地上部As的含量。图4为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，木质部汁液中As含量量明显减少。图5为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，叶片和种壳As含量显著降低。A：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在湖南郴州As污染土(85.8mg/kgAs)中；B：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在浙江上虞As污染土(75.8mg/kgAs)中。图6为OsNIP3；3超表达材料与野生型相比，籽粒As含量显著降低40-50％左右。A：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在湖南郴州As污染土(85.8mg/kgAs)中；B：OsNIP3；3超表达材料和野生型生长在浙江上虞As污染土(75.8mg/kgAs)中。具体实施方式：以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例1水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在非洲爪蟾卵母细胞中的运输活性试验。根据NIP3；3、NIP2；1(Lsi1)和NIP3；1基因的cDNA读码框序列，设计PCR引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，引物序列见下表。扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，并分离后切胶回收，产物回收后用相应限制性内切酶进行酶切，同时酶切蛙卵表达载体pT7TS,将酶切过的载体与PCR片段用T4连接酶连接，转化到大肠杆菌中并提取阳性克隆进行酶切以及DNA测序鉴定。检测正确的质粒经过线性化处理后，利用mMESSAGEmMACHINE(Ambion)试剂盒合成NIP基因的单链cRNA.50ng/oocyte的cRNA被显微注射入蛙卵中，以注射水为对照，注射后蛙卵置于ModifiedBarth’sSaline(MBS)培养液在18℃中进行48至72小时的蛋白表达，之后应用含有100μM亚砷酸的MBS营养液分别处理蛙卵30-60分钟，处理后用营养液彻底清洗蛙卵并收集利用硝酸消解，最后经ICP-MS检测As元素总量，从而分析不同NIP基因对上述底物的转运能力。本实施例的研究表明水通道蛋白编码基因OsNIP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累的超表达载体，其特征在于所述的超表达载体为含有水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的重组表达载体；所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在Genbank中的登录号为AB710141。

【技术特征摘要】
1.一种用于减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻地上部与籽粒砷的积累的超表达载体，其特征在于所述的超表达载体为含有水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的重组表达载体；所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在Genbank中的登录号为AB710141。2.根据权利要求1所述的超表达载体，其特征在于以pTCK303载体为出发载体，将所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3的开放阅读框序列插入出发载体SpeI及KpnI酶切位点间所得。3.权利要求1所述的所述的水通道蛋白编码基因OsNIP3；3在减少水稻根系中三价砷向木质部的转运，降低水稻...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方杰，孙晟凯，唐仲，黄新元，马建锋，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32