EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤生物治疗技术领域，具体涉及EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用。所述EPS8L1基因的shRNA序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14。本发明专利技术实现了EPS8L1基因在抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭和转移，提高患者的生存率。

Application of EPS8L1 gene in the treatment of ovarian cancer

【技术实现步骤摘要】
EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用
本专利技术涉及肿瘤生物治疗
，具体涉及EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用。
技术介绍
卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中排名第三，但死亡率却位居妇科肿瘤之首，其中85-90％为上皮性卵巢癌。究其原因是上皮性卵巢癌的高转移倾向和治疗过程中化疗耐药所导致的复发。约70％的卵巢癌患者在就诊时已是晚期，又有70％的患者在治疗后复发，需要再次手术和化疗。因此，卵巢癌严重危害着女性的健康，治疗过程中沉重的经济负担使很多家庭因病致贫。转移是上皮性卵巢癌最重要的生物学特征，也是导致患者死亡的主要原因。有文献报道，根据国际妇产科协会(FIGO)分期，Ⅰ期的卵巢癌患者五年生存率可达90％左右，Ⅱ期患者仍有60-80％的五年生存率，但是发生转移的Ⅲ和Ⅳ期患者，五年生存率锐减为2-35％。因此，临床分期一直被认为是影响上皮性卵巢癌预后的最重要因素之一。肿瘤播散、转移的范围越广、临床分期越晚、患者的生存率越低。上皮性卵巢癌的转移除了以腹腔种植为主的转移外，还有经脉管系统的转移，前者可刺激产生腹水，是上皮性卵巢癌发生转移的特征。肿瘤转移是一个多步骤的癌细胞与宿主细胞间相互作用的连续过程。细胞的上皮-间质转化(epithelial–mesenchymaltransitions，EMT)、迁移是肿瘤转移的基础，涉及肌动蛋白细胞骨架重组的复杂过程。细胞迁移由几个循环往复的步骤组成，即头部伪足形成和延伸、新粘附位点的建立、胞体的收缩及尾部的退缩，细胞通过不断重复这个过程，逐渐向前移动。对这一过程精确调控的分子机制非常复杂，涉及细胞内多条信号转导通路，包括多种癌基因的活化和抑癌基因的失活。研究较多的癌基因有Ras、Myc、SRC、EGFR、Erbb2、CTNNB1等，研究较多的抑癌基因有p53、pl6、p21、PTEN、Runx3、MDM2、FHIT等。但在临床实践中，这些分子标记物在预测卵巢癌转移方面的作用仍然十分有限。因此，如果能发现及研究卵巢癌细胞发生转移的关键分子及相关机制，不但能为寻找预测卵巢癌患者发生转移风险的生物标记物提供科学依据，更有望为已经发生转移的患者提供可能的干预靶点，以阻断肿瘤的浸润转移、控制腹水生成，提高生存质量，延长生存时间，改善上皮性卵巢癌患者的预后。利用二代测序技术对31例上皮性卵巢癌患者的肿瘤和正常卵巢组织进行转录组测序(RNA-Seq)，通过生物信息学分析RNA-Seq数据，发现了4908个差异基因(foldchange＞2，p＜0.05)，建立了一个云南地区上皮性卵巢癌差异RNA数据库。其中表皮生长因子受体通路底物8相关蛋白1(epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstrate8-relatedprotein1,EPS8L1)在上皮性卵巢癌组织中较正常卵巢组织上调了20.266倍，且该基因在两组样本(癌VS正常组织)中的表达一致性较高，通过文献检索和数据库比对，我们推测EPS8L1可能与肿瘤的转移和侵袭有关，目前国内外尚无EPS8L1基因在卵巢癌中的相关报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了EPS8L1基因在抑制卵巢癌治疗中的应用。具体技术方案为：EPS8L1基因，其特征在于，所述EPS8L1基因的shRNA序列如SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7。优选的，所述EPS8L1基因在抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭和转移中的应用。优选的，所述EPS8L1基因敲低后，上皮性卵巢癌细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂IC50值降低，敏感性增强。有益效果：运用基因编辑技术构建了EPS8L1过表达和敲低质粒，经慢病毒转染上皮性卵巢癌细胞株ES-2，初步探索了EPS8L1基因过表达/敲低后对ES-2细胞功能的影响，EPS8L1基因敲低后，ES-2细胞的增殖能力下降，细胞生长平台期提前；EPS8L1基因过表达后，细胞的迁移能力增强。EPS8L1基因敲低后，卵巢癌细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂IC50值降低，敏感性增强，EPS8L1基因敲低后，ES-2细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂IC50值降低，敏感性增强；EPS8L1基因敲低后，ES-2细胞对卡铂IC50值降低，敏感性增强。实现EPS8L1基因在抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭和转移，提高患者的生存率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为EPS8L1基因敲低后对ES-2细胞功能的影响；图2为EPS8L1基因过表达后对ES-2细胞功能的影响；图3为EPS8L1基因敲低后对紫杉醇、阿霉素、顺铂敏感性的影响；图4为EPS8L1基因敲低后对卡铂敏感性的影响。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一、沉默EPS8L1体系的建立，利用RNAi干扰技术沉默EPS8L1基因的具体方法如下：感染预实验1、确认合适的感染条件，按照不同培养基条件将实验分为4组：A组：常规培养基，观察常规培养基条件下病毒对细胞的感染效果；B组：常规培养基+Polybrene组，观察Polybrene是否可以提升感染效果；C组：ENi.S.组，观察用ENi.S.替代常规培养基时病毒对细胞的感染效果；D组：ENi.S.+Polybrene组，观察Polybrene和ENi.S.条件下病毒对细胞感染效果；Control组：监控实验过程中细胞生长是否正常。Day1:接种细胞用完全培养基制备2ml密度为3～5×104个/ml的细胞悬液，取100μl/孔加入96孔板中，共15个孔，其中3个孔作为Control组，继续培养。Day2：感染用ENi.S.将慢病毒一次稀释成1×108TU/ml,1×107TU/ml,1×106TU/ml,各50μl。用ENi.S.将Polybrene稀释成50μg/ml,共200μl，标记为P(E)；用常规培养基将Polybrene稀释成50μg/ml,共200μl，标记为P(M)吸掉各孔中上清液，按照表1加入相应体积的溶液，混匀，继续培养。感染12h换回常规培养基，过程中观察细胞形态，保持细胞正常生长。Day3～4：继续培养中途可根据细胞的生长状况进行换液，保持细胞活性。Day5：感染效果确认感染约72h，荧光表达丰度较高时，用显微镜观察。感染效率80％左右，且细胞生长良好的组所对应的感染条件和MOI即可以作为后续感染实验的依据。表1为感染预实验实验分组和感染条件；表1感染正式实验Day1:接种细胞用完全培养基制备密度为3～5×104个/ml的细胞悬液，并根据表2接种相应的细胞数到培养板中。Day2:感染1.按照预实验结果，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.EPS8L1基因，其特征在于，所述EPS8L1基因的shRNA序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14。

【技术特征摘要】
1.EPS8L1基因，其特征在于，所述EPS8L1基因的shRNA序列如SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿晨，张磊，罗敏，杨宏英，陈亚娟，朱绍艳，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53