应用细菌展示文库筛选特异结合DDX24解旋酶的多肽制造技术

本发明专利技术公开了一系列应用细菌展示文库筛选鉴定特异结合DDX24解旋酶的多肽，具体涉及八条多肽，分别具有下列氨基酸序列：1：STFVKSCYQCVMYAL；2：EWWEGLW；3：TMDDIWDSLSMGRSA；4：SWYEWAHDFWGTGMG；5：LWSAWEAGVLPPGDW；6：DAGWWMSGCGTAGCR；7：MWMENAWDTMGGRQT；8：IWDDWESGRMSRVSA。这些多肽是利用细菌展示文库通过特定步骤筛选出多肽，具有与血管畸形致病基因DDX24解旋酶特异性结合的能力。因此本发明专利技术及其衍生物可以作为血管畸形疾病或者其他与DDX24相关疾病的前体或先导物。

【技术实现步骤摘要】
应用细菌展示文库筛选特异结合DDX24解旋酶的多肽
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及应用细菌展示文库筛选鉴定特异结合DDX24解旋酶的一系列多肽。
技术介绍
目前血管畸形发病率高，绝大部分的发病机制尚不明确，诊断和治疗均存在极大的困难；尤其是内脏血管畸形，由于发病部位隐匿，主要依赖MRI、CT等影像检查才能发现，大多数病人就诊时已发生严重并发症。血管畸形致病基因DDX24（DEAD‐boxhelicase24）[PengfeiPangetal.DDX24MutationsAssociatedWithMalformationsofMajorVesselstotheViscera.Hepatology2019;69:803-816]的发现为临床研究提供了新方向，有望成为血管畸形新的诊断依据和治疗靶点。现有细菌展示文库，通常是对纯化了的蛋白进行筛选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体，在此基础上我们运用了细菌展示技术对细胞表面抗原进行筛选，通过这种方法可以得到对细胞表面特异结合的多肽分子。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复杂而且未知，细胞筛选的非特异性较大，背景值高。相比于噬菌体文库筛选，其可避免许多缺点。比如，外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配，使其失去感染力；多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等。
技术实现思路
本专利技术的目在于：提供一系列利用细菌展示文库通过特定步骤筛选鉴定出特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该系列多肽能特异性识别DDX24解旋酶。特异性识别DDX24解旋酶的多肽，所述多肽包括如下所示的特征序列部分：多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu;多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp;多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;多肽4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;多肽5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;多肽6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;多肽7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;多肽8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val-Ser-Ala。进一步的，利用细菌展示文库通过特定步骤筛选出多肽；特定步骤如下：（1）经过1-2轮的磁珠筛选技术（Magneticcellsorting，MACS），运用包被了Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1（以下简称SA-beads）的磁珠结合biotin-DDX24解旋酶，孵育细菌多肽库（X15多肽库），获得富集了结合多肽的细菌库；（2）经过7-8轮的荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activatedcellsorting，FACS）分选，减少蛋白的剂量，同时加入血清等物质以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选；（3）单克隆确定，选出20个克隆做细菌表面多肽的亲和力、特异性初筛，送克隆测序。所述多肽可以结合、封闭、拮抗DDX24解旋酶。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的系列多肽可作为血管畸形疾病或者其它与DDX24解旋酶相关的疾病的诊断标志物，并应用于开发抑制血管畸形疾病或者其它与DDX24相关疾病靶向治疗药物的前体或先导物。本专利技术还包括将上述系列多肽应用于荧光、化学发光、核素等标记，用于设计、制备预防和/或治疗内脏血管畸形或者其它与DDX24相关疾病药物中的应用。附图说明图1：将细菌文库与生物素标记的特异结合DDX24解旋酶的多肽共孵育，获得富集了该结合多肽的细菌库。接着进行MACS和多轮的FACS分选，以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选。图2：对F2、F3、F4、F5的细菌表面多肽结合率检测图（DDX24蛋白浓度为5nmol/L，SAPE染色。图3：与DDX24解旋酶特异结合的多肽列表。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详细予以说明，这并不限制本专利技术的范围。本专利技术实施例为：提供一系列利用细菌展示文库通过特定步骤筛选鉴定出特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该系列多肽的序列包括：多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu;多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp;多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;多肽4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;多肽5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;多肽6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;多肽7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;多肽8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val-Ser-Ala。其中用细菌展示文库筛选出多肽的特定步骤如下：（1）经过1-2轮的磁珠筛选技术（Magneticcellsorting，MACS），运用包被了Dynabeads®MyOne™StreptavidinC1（以下简称SA-beads）的磁珠结合biotin-DDX24解旋酶，孵育细菌多肽库（X15多肽库），获得富集了结合多肽的细菌库；（2）经过7-8轮的荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activatedcellsorting，FACS）分选，减少蛋白的剂量，同时加入血清等物质以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选；（3）单克隆确定，选出20个克隆做细菌表面多肽的亲和力、特异性初筛，送克隆测序。具体实施方式1：DDX24解旋酶的纯化：为了体外获得重组的DDX24蛋白，装有DDX24基因（28-859aa，基于57062Pubmed序列文库号）经BamhI和HindIII酶切位点连接到pSUMO载体，在DH5α菌获得重组质粒，经测序验证无误，转入表达菌：BL21（DE3）进行蛋白纯化。将质粒转化至BL21(DE3)，37度200转摇至吸光度0.6-0.8，加入终浓度0.1mMIPTG（索莱宝，SBJ-F2160），16度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，所述特征序列部分包括:多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu;多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp;多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;多肽4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;多肽5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;多肽6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;多肽7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;多肽8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，金红军，李志军，杨帅，陈守登，陈秋樾，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44