用于调准激光扫描荧光显微镜的方法和具有自动调准设备的激光扫描荧光显微镜技术

为了调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，在所述正确调准中激励光(6)的最大强度(1)和荧光阻止光(7)的最小强度(4)和/或布置在荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像在镜头(20)的焦点中重合，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，并且由在所述图像中所述结构的所述影像(3，30，31，32)计算和补偿在所产生的图像中所述结构的成像的位置之间的错位(8)。在此，所产生的图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度和/或所述光阑(2)的不同光阑开口。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于调准激光扫描荧光显微镜的方法和具有自动调准设备的激光扫描荧光显微镜
本专利技术涉及一种用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的方法，在所述正确调准中激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像(Abbildung)在镜头的焦点中重合。本专利技术尤其涉及一种以下方法：该方法为了调节调准使用以下度量(Metrik)，计算该度量并且该度量能够实现精确的自动调准。此外，本专利技术涉及一种激光扫描荧光显微镜，其具有用于实施这种方法的自动调准设备。激光扫描荧光显微镜尤其是具有布置在荧光探测器前的光阑的共焦的显微镜和/或高分辨率的激光扫描荧光显微镜，在所述高分辨率的激光扫描荧光显微镜的情况下通过具有最小强度的荧光阻止光提高分辨率。荧光阻止光尤其可以是所谓的STED光或转换光，该STED光或该转换光通过受激地发射或通过转化到黑暗状态中阻止荧光着色剂发射荧光。
技术介绍
由T.J.Gould等人的《Auto-aligningstimulatedemissiondepletionmicroscopeusingadaptiveoptics》(光学快报，第38卷，第11号(2013)1860-1862)和US2015/0226950A1已知一种用于调准STED激光扫描荧光显微镜的传统的方法和一种用于调准STED激光扫描荧光显微镜的使用度量的方法，以便将经聚焦的STED光的最小强度对准经聚焦的激励光的中心。在传统的方法的情况下，对金颗粒的散射光进行成像，并且使STED光的和激励光的焦点的位置相对彼此地移位，直至其点分布函数彼此取向。传统的方法需要将STED激光扫描荧光显微镜切换到散射光成像模式中，并且通常基于手动地调节STED光的和激励光的焦点的位置。在使用度量的已知的方法的情况下，对于STED光的和激励光的焦点的不同相对位置由STED图像的亮度和清晰度计算出度量，并且根据以下情况确定最佳的相对位置：度量取最大值。随后可以紧接着细调准，在该细调准的情况下使用第二度量，在第二度量中仅涉及STED图像的亮度。第二度量基于以下：如果STED光的最小强度的位置对准激励光的最大强度的中心，那么STED图像最亮。为了证明使用度量的已知的方法的功能，在使用度量的调准前或在使用度量的调准后比较以相同的激光扫描荧光显微镜记录的共焦图像和STED图像。在还未经调准的显微镜的情况下，在STED图像和共焦图像中发荧光的颗粒的图像的重心彼此偏差，而在经调准的激光扫描荧光显微镜的图像中的重心除了4.3+/-2.3nm的错位以外重合。对于这个值应注意的是，该值远远低于在大多的STED显微镜的典型的局部分辨率并且该值未示出优先方向。为了使STED光的和激励光的焦点相对移位，提出在STED光的射束路径中使用空间光调制器(SLM)。由文献DE102007011305A1已知用于在具有至少两个彼此独立的光源的光学射束路径中进行射束调准的一种设备和一种方法。在此，尤其涉及高分辨率的STED激光扫描荧光显微镜的射束路径。光源的射束在共同的照射射束路径中叠加。暂时将校准标本——根据该校准标本可以检查射束的瞳孔位置和/或焦点位置——引入到照射射束路径中。具体地，可以在照射射束路径中在中间图像的位置处或在中间图像的附近引入校准标本，并且该校准标本具有表面结构。为了调准目的，设有至少一个调节元件以影响要合并的射束中的至少一个射束的瞳孔位置和/或焦点位置。已知的借助校准标本的射束调准不考虑以下光学元件的影响：所述光学元件在照射射束路径中处于校准标本的后面。换句话说，校准标本仅仅允许在中间图像的范围内进行调准，但是不允许在样品中在镜头的焦点的范围内进行调准。由EgidijusAuksorius等人的《Stimulatedemissiondepletionmicroscopywithasupercontinuumsourceandfluorescencelifetimeimaging》(光学快报，第33卷，第2号，2008年1月1日，第113-115页)已知，如果如此选择激励脉冲与STED脉冲之间的延迟，使得在产生的STED图像的情况下实现最大的空间分辨率，那么样品的被记录的第一荧光光子未收到高分辨率的信息，而是相应于传统的共焦图像，从而才基于随后记录的荧光光子计算出高分辨率的STED图像。在JohannaBückers等人的《Simultaneousmulti-lifetimemulti-colorSTEDimagingforcolocalizationanalyses》(光学速递，第19卷，第4号，2011年2月14日，3130-3143页)中，参见Auksorius等人(参见以上)阐述如下：以STED显微术记录的第一光子还包含更远离STED射束的零点的荧光体的份额即还不包含具有最高的局部分辨率的信息。在MontyGlass等人的《Theexperimentaleffectofdetectorsizeonconfocallateralresolution》(JournalofMicroscopy，第164卷，第2号，1991年11月1日，第153-158页)中推测出：在移过点反射器时，在理论上的探测器信号与根据实验的探测器信号之间的横向移位归因于光学系统的误对准或使用真实的、色散(aberriert)的透镜代替如理论上假设的那样的完美的薄透镜。由JP2002-277746A已知，如此定位光阑，使得该光阑允许通过最大光量到探测器上。对于减小的光阑直径迭代地实施这种光阑调准。
技术实现思路
本专利技术的任务本专利技术基于以下任务：提出一种用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的方法和一种相应的激光扫描显微镜，所述方法和所述激光扫描显微镜能够直接在镜头的焦点中和在激光扫描荧光显微镜的荧光成像模式下实现快速的有针对性(zielgericht)的调准。解决方案本专利技术的任务通过一种具有独立权利要求1的特征的方法和一种具有独立权利要求7的特征的方法解决。从属权利要求2至6和8至17涉及根据本专利技术的方法的优选的实施方式。权利要求18设置用于实施根据本专利技术的方法的激光扫描荧光显微镜。本专利技术的描述在用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的根据本专利技术的方法的情况下，在所述正确调准中激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像在镜头的焦点中重合，其中，以激励光的最大强度扫描在样品中以荧光着色剂标记的结构，以便产生具有该结构的影像(Abbilder)的样品的图像，其中，由在图像中结构的影像计算表示与正确调准的偏差的度量，所产生的图像相应于荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口，并且该度量是在所产生的图像中结构的影像的位置之间的错位。“所产生的图像相应于荧光阻止光的不同强度”意味着：荧光阻止光的最大强度是不同的，具体地随荧光阻止光的强度而增大，该最大强度确定荧光阻止光的最小强度的大小并且因此确定以荧光阻止光可实现的空间分辨率。荧光阻止光的相对于其最大强度归一化的空间强度分布在此通常在所有图像的情况下保持相等，该空间强度分布包括最小强度。但是一旦空间分辨率随荧光阻止光的强度而增大，这就不是一定的。原则上由T.J.Gould(2013)已知：在未根据规定地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，激励光(6)的最大强度(1)和荧光阻止光(7)的最小强度(4)在镜头(20)的焦点中重合，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，其中，所产生的图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度，其中，计算在所产生的图像中所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的错位(8)，其特征在于，为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使所述激励光(6)的最大强度(1)相对于所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)在所述错位(8)的方向上移位，在相应于所述荧光阻止光(7)的较高强度的图像中所述结构的影像(30)相对于在相应于所述荧光阻止光(7)的较低强度的另一图像中所述结构的影像(3)具有所述错位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.05 EP 16187303.91.一种用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，激励光(6)的最大强度(1)和荧光阻止光(7)的最小强度(4)在镜头(20)的焦点中重合，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，其中，所产生的图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度，其中，计算在所产生的图像中所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的错位(8)，其特征在于，为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使所述激励光(6)的最大强度(1)相对于所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)在所述错位(8)的方向上移位，在相应于所述荧光阻止光(7)的较高强度的图像中所述结构的影像(30)相对于在相应于所述荧光阻止光(7)的较低强度的另一图像中所述结构的影像(3)具有所述错位。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使布置在所述激光扫描荧光显微镜(15)的荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像相对于所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)在错位(8)的方向上移位，其中，所述成像在所述正确调准的情况下与所述激励光(6)的最大强度(1)和所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)在所述镜头(20)的焦点中重合，其中，在相应于所述荧光阻止光(7)的较高强度的图像中所述结构的影像(32)相对于在相应于所述荧光阻止光(7)的较低强度的另一图像中所述结构的影像(31)具有所述错位。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使所述激励光(6)的最大强度(1)或所述光阑(2)的成像(5)移位以下程度：所述程度相应于F倍的错位(8)，其中，F大于或等于1，其中，F是所述荧光阻止光(7)的不同强度的函数，所述图像和所述另一图像相应于所述不同强度。4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以所述激励光(6)的最大强度(1)重复地扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，逐图像地改变所述荧光阻止光(7)的强度，以便产生所述样品(22)的图像，所述图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，一次以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，产生原始图像，在所述原始图像中所述样品(22)的两个图像叠加，所述两个图像能够分配给所述荧光阻止光(7)的不同强度，其方式是：借助所述激光扫描荧光显微镜(15)的荧光探测器(18)对于以下时间段记录所述样品(22)的荧光(19)：所述时间段处在所述荧光阻止光(7)起作用前和/或所述荧光阻止光(7)起作用后，其中，由所述原始图像求取两个叠加的图像。6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在使用所述错位(8)的情况下，在所述镜头(20)的焦点中相对于所述激励光(6)的最大强度(1)和所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)将另一荧光阻止光(7)的另一最小强度(4)调节到正确调准。7.一种用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，激励光(6)的最大强度(1)和布置在所述荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像(5)在镜头(20)的焦点中重合，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，其特征在于，所产生的图像相应于所述光阑(2)的光阑开口，计算在所产生的图像中在所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的错位(8)，并且为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使所述激励光(6)的最大强度(1)相对于所述光阑(2)的成像在所述错位(8)的方向上移位，在相应于所述光阑(2)的较小的光阑开口的图像中所述结构的影像(30)相对于在相应于所述光阑(2)的较大的光阑开口的另一图像中所述结构的影像(3)具有所述错位。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使所述激励光(6)的最大强度(1)移位以下程度：所述程度相应于F倍的所述错位(8)，其中，F大于或等于1，其中，F是在所述图像和所述另一图像中所述结构的空间分辨率的函数。9.根据权利要求6和7中任一项所述的方法，其特征在于，以所述激励光(6)的最大强度(1)重复地扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，逐图像地改变所述光阑(2)的光阑开口，以便产生所述样品(22)的图像，所述图像相应于所述光阑(2)的不同光阑开口。10.根据以上权...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·海涅，M·罗伊斯，B·哈尔克，L·卡斯特鲁普，
申请(专利权)人：阿贝里奥仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE