调整在显微镜中使用的估计器的方法、计算机程序和装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种方法、一种计算机程序和一种装置，其用于调整在显微镜中使用的估计器，以用于基于在一组或多组探测位置处用光照射样本并针对该组探测位置获取荧光光子的方法来估计样本中的发射体的位置。本发明专利技术还涉及一种利用这种调整方法或装置的显微镜。根据本发明专利技术，样本在一组或多组探测位置处被用光照射(S1)，并且针对该组探测位置获取(S2)荧光光子。然后，将所获取(S2)的光子的光子计数添加(S3)到针对该组探测位置确定的光子计数向量或光子计数总和中。随后，从光子计数向量或光子计数总和确定(S4)代表背景噪声的值。然后，代表背景噪声的值用于实时调整(S5)估计器。代表背景噪声的值用于实时调整(S5)估计器。代表背景噪声的值用于实时调整(S5)估计器。

【技术实现步骤摘要】
调整在显微镜中使用的估计器的方法、计算机程序和装置


[0001]本专利技术涉及一种用于调整在显微镜中使用的估计器以估计样本中的发射体的位置的方法、计算机程序和装置。本专利技术还涉及一种利用这种方法或装置的显微镜。

技术介绍

[0002]由于STED(STimulated Emission Depletion)[2]和RESOLFT(Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions)[3]所代表的坐标定位超分辨率族(Coordinate
‑
targeted Super
‑
resolution family)[1]的具体优势以及其包括PALM(Photo Activated Localization Microscopy)/STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)[4]和PAINT(Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)[5]的坐标随机对应物的协同组合，荧光显微镜经历了第二次分辨率提升。所产生的被称为MINFLUX(Minimal photon Flux，最小光子通量)[6]的协同设计已经将普遍的分辨率差距从STED、PALM/STORM和其他荧光纳米镜中的～20
‑
30纳米缩小到分子本身的1
‑
5纳米的尺寸尺度。
[0003]在其核心，MINFLUX定位基于使用结构化光束在样本中注入参考坐标的重要原理，例如具有中心强度最小值(即零)的圆环。样本中的零的位置定义了目标样本坐标。MINFLUX设计同样适用于整组的参考坐标，即线状和点状零点，以及宽场中的并行检测。坐标对准能够良好控制地并因此具有光子效率地对荧光分子进行定位，因为不再通过建立照相机上出现的微弱的、衍射受限的荧光点的中心，来寻找待确定的荧光团坐标。替代地，荧光团是通过主动将激发圆环的零点对准到荧光团来定位的。具体地，在经过深思熟虑的迭代中，激发强度的零点尽可能接近分子，直到检测到的荧光率与背景噪声的荧光率大致匹配。在这个最近的邻近中，只需要最少数量的荧光光子即可获得最大的定位精度，因为在圆环零点目标坐标与分子位置之间建立剩余距离需要更少的检测到的光子。因此，“注入”或对准样本中的参考坐标将需要大量荧光光子以用于定位的负担转移到圆环形的激发光束中无穷无尽的数量的光子上。
[0004]由于MINFLUX定位不再受等待大量荧光光子的限制，因此这种纳米级精确定位比PALM/STORM中所使用的基于照相机的定位要快得多。使用圆环零点光学地注入坐标的构思也因此固有地存在于原始的STED设计中。对于STED显微镜，明显的是，在没有背景的情况下，单个检测到的光子足以证明在圆环零点目标坐标处存在荧光团。在那里，发射荧光团也被STED光束所注入的光子完美地定位。
[0005]利用无偏估计器能够实现的最小定位精度(即用于对位于由目标坐标图案所勾勒的直径L区域内的荧光团进行定位的克拉美
‑
罗下界(Cram
é
r
‑
Rao lower bound，CRLB))由给出，其中N表示以位于目标坐标图案的坐标处的零点所检测到的光子的总和。对目标坐标图案的直径L的依赖性是线性的，而对检测到的光子数量N的依赖性只是遵循众所周知的平方根倒数关系。因此，使激励圆环的零点更接近荧光团的位置，即受控地减少目标坐标图案的直径L，比等待更大数量N的检测到的光子更有效地提高定位精度。这
一基本事实是迭代式MINFLUX方法的核心，其发挥了将圆环的零点与被探测的荧光团在空间上重合的中心构思，这一过程只受到背景噪声的限制。对于包括一组外三角形加上中央探测点(outer triangular plus central probing point)的目标坐标图案的一般情况，以逐步减少的L
k
连续放大分子是用于完善位置估计的可行策略，其中L
k
选择为σ
(k
‑
1)
(即，前一次迭代的不确定性)的三倍。在数量为k的少量的迭代之后，由此对于每次迭代的光子数量相同或相似的情况下所检测到的光子的组合的N
t
＝k
·
N，CRLB变为：
[0006][0007]已经四个步骤(即，k＝4)产生了即依赖于所检测到的光子的数量N
t
的二次函数的倒数，而不是平方根函数的倒数。更多的迭代很容易产生更高的阶数，反映出指数关系。同样重要的是，每次迭代中所收集的光子数量不必相同。相反，其可以在迭代过程中针对其最有效的开销单独进行调整。
[0008]对MINFLUX测量的样本优化通常围绕为样本寻找正确的成像条件，例如激光功率或缓冲液成分，这通常通过具有调整后的参数的连续测量来完成。为了促进例程并普遍提高样本吞吐量，非常需要在测量期间即时呈现最终的定位数据，因为其允许在测量开始后不久就已经可以判断样本的质量。
[0009]超分辨成像的一种可能模态利用具有功率斜坡的迭代MINFLUX成像。这种方法通过将随机估计器应用于数据，从在探测位置组处所测量的光子计数中推导出样本中的发射体的位置。该方法由于以下事实而变得复杂：为了获得无偏结果、即没有系统误差的结果，必须考虑特定的实验条件，例如圆环的空间强度分布和信噪比。到目前为止，这些条件已经被定位数据的耗时的后处理考虑在内[6]、[6a]、[7]、[8]。

技术实现思路

[0010]本专利技术要解决的技术问题是，提供一种实时调整在显微镜中使用的估计器的解决方案。
[0011]该技术问题通过根据本专利技术的方法、根据本专利技术的实现该方法的计算机程序、根据本专利技术的装置以及根据本专利技术的显微镜来解决。本专利技术包括如下所述的本原理的有利的进一步发展和改进。
[0012]根据第一方面，本专利技术涉及一种用于调整在显微镜中使用的估计器的方法，以用于基于在一组或多组探测位置处用光照射样本并针对该组探测位置获取荧光光子的方法来估计样本中的发射体的位置，所述用于调整在显微镜中使用的估计器的方法包括：
[0013]‑
在一组或多组探测位置处用光照射样本；
[0014]‑
针对该组探测位置获取荧光光子；
[0015]‑
将所获取的光子的光子计数添加到针对该组探测位置的光子计数向量或光子计数总和中；
[0016]‑
从光子计数向量或光子计数总和确定代表背景噪声的值；以及
[0017]‑
使用代表背景噪声的值实时调整估计器。
[0018]通过将所获取的光子的光子计数添加到针对该组探测位置的光子计数向量或光
子计数总和中，从所获取的光子针对该组探测位置确定光子计数向量或光子计数总和。
[0019]相应地，计算机程序包括指令，当由至少一个处理器执行指令时，该指令使至少一个处理器本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于调整在显微镜(10)中使用的估计器(35)的方法，以用于基于在一组或多组(TCP)探测位置(P
i
)处用光照射样本并针对该组(TCP)探测位置(Pi)获取荧光光子的方法来估计样本(1)中的发射体(2)的位置，所述用于调整在显微镜中使用的估计器的方法包括：
‑
所述样本(1)在一组或多组(TCP)探测位置(Pi)处被用光(13)照射(S1)；
‑
针对该组(TCP)探测位置(Pi)获取(S2)荧光光子；
‑
将所获取(S2)的光子的光子计数添加(S3)到针对该组(TCP)探测位置(Pi)的光子计数向量(SIP)或光子计数总和(ΣSIP)中；
‑
从所述光子计数向量(SIP)或所述光子计数总和(ΣSIP)确定(S4)代表背景噪声的值(EBG)；以及
‑
使用所述代表背景噪声的值(EBG)实时调整(S5)所述估计器(35)。2.根据权利要求1所述的方法，其中，为了确定(S4)代表背景噪声的值(EBG)，仅评估没有检测到来自发射体(2)的荧光的探测位置(Pi)的组(TCP)。3.根据权利要求2所述的方法，其中，为了确定是否检测到来自发射体(2)的荧光，将针对一组(TCP)探测位置(Pi)的光子计数总和(ΣSIP)与从当前所估计的背景导出的阈值进行比较。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述光子计数总和(ΣSIP)被添加到直方图(HST
k
)。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述直方图(HST
k
)是特定于每次扫描迭代的。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述代表背景噪声的值(EBG)从直方图(HST
k
)的峰值导出。7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述估计器(35)被调整(S5)为使得在估计发射体(2)的位置之前从光子计数中减去背景噪声的期望值。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述估计器(35)使用校准多项式，所述校准多项式是特定于多个扫描迭代中的每一个的。9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，探测位置(Pi)的组(TC...

【专利技术属性】
技术研发人员：R施密特，
申请(专利权)人：阿贝里奥仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：