一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法。该方法包括如下步骤：(1)采用甲醇提取蘑菇子实体得到毒素提取液；(2)采用HPLC检测所述毒素提取液，得到鹅膏毒肽的吸收峰的峰面积；(3)采用鹅膏毒肽的标样配制标准溶液，然后采用HPLC检测所述标准溶液，得到不同进样量时的峰面积，进而得到所述鹅膏毒肽的标样的进样量与峰面积之间的线性回归方程；步骤(2)和(3)中HPLC检测的条件相同；(4)根据步骤(2)中得到的峰面积与步骤(3)得到的线性回归方程，即得到蘑菇中鹅膏毒肽的含量。本驸马方法可用于蘑菇中鹅膏毒肽的定量检测，适用于山东乃至泰山毒蘑菇种类资源多样性的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法
本专利技术涉及一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，属于食品安全检测领域。
技术介绍
蘑菇属于大型真菌，包括野生食用菌和药用菌，其中少数为毒蘑菇。毒蘑菇含不同类型致害毒素(卯晓岚，1987)。19世纪60年代，人类首次从毒蝇鹅膏菌Amanitamuscaria(L.)发现致害毒素(Schimedebergetal，1869)。目前已报道了毒蘑菇含九大类毒素：鹅膏毒环肽、单甲基肼毒素、丝膜菌毒素、毒蝇碱、鹅膏蕈氨酸、鬼伞菌素、裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素、胃肠道刺激剂以及亚稀褶黑菇毒素(刘吉开，2004)。毒蘑菇毒素致毒症状分为胃肠型、神经型、溶血型、肝脏损害型、呼吸与循环衰竭型和光过敏性皮炎型等6大毒害症状(卯晓岚，2006)。鹅膏毒环肽为强致命型毒素，该类毒蘑菇毒素主要存在于鹅膏属毒蘑菇菌体，很小剂量(LD500.1mg/kg)可致人于死亡，比氰化物毒性高十余倍(Wieland，1986)。鹅膏菌肽类毒素目前已发现有22种(Wieland，1986)。肽类毒素均是环肽化合物，根据其氨基酸组成和结构可分为三类：鹅膏毒肽类、鬼笔毒肽类和毒伞毒肽类。鹅膏毒肽是一类双环八肽的碳环骨架的结构，其结构式如式1所示，其化学性质稳定，耐高温，耐酸碱。鹅膏毒肽有很强的致死性，其作用位点为真核细胞的细胞核(Wieland，1986)。该类毒素目前已发现9种，从表1可知，它们的氨基酸组成差异较小，主要差异仅在于其侧链的不同取代基团(见表2)。以下分别是几种重要鹅膏毒肽的分子式：C39H54N10O14S(α-amanitin)、C39H53O15S(β-amanitin)以及C39H54N10O13S(γ-amanitin)。表1鹅膏毒肽毒素的氨基酸组成表2鹅膏毒肽毒素的侧链基团及毒性**来源于文献(Vetter,1998)。为了快速有效的检测毒蘑菇是否含鹅膏毒素，研制了纸鲜蘑菇压汁印迹干后浓盐酸悬滴显色法，快速有效的检测鲜菇鹅膏毒素的有无(Wieland，1949)，之后Wieland又用1％肉桂醛甲醇液，在浓盐酸存在下，鹅膏毒素显深紫色，鬼笔毒肽显黄棕色，后呈浅兰色；后来又对这些方法进行了改进，进一步优化改进建立了毒蘑菇主要毒害成分的常规检测方法。1981年Beuthler&Marderosin首次采用高效液相色谱法(HPLC)检测鹅膏菌肽毒素。随后Pastorelllo等(1982)也采用HPLC法检测α-鹅膏毒肽。1983年Silva尝试用HPLC法检测食毒人体中α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽。HPLC法因具快速、灵敏等优点，在蘑菇毒素检测中被广泛使用(Enjalbertetal，1993，1999)。20世纪90年代，我国学者张志光首先采用HPLC法检测分析了湖南、湖北等省的鹅膏菌种类鹅膏毒肽，检测发现了东亚特有种和优势种—灰花纹鹅膏菌毒素含量高。此外，陈作红(2003)、胡劲松(2003)及包海鹰(1999)等人也用HPLC方法检测了其他多种鹅膏菌的毒素含量，综合评价了我国热带和寒带地区毒蘑菇的鹅膏菌毒素含量及其变化动态，为误食毒蘑菇病情快速诊断与及时治疗提供可行的技术方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，可用于蘑菇中鹅膏毒肽的定量检测，适用于山东乃至泰山毒蘑菇种类资源多样性的特点。本专利技术所提供的检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，包括如下步骤：(1)采用甲醇提取蘑菇子实体得到毒素提取液；(2)采用HPLC检测所述毒素提取液，得到鹅膏毒肽的吸收峰的峰面积；(3)采用鹅膏毒肽的标样配制标准溶液，然后采用HPLC检测所述标准溶液，得到不同进样量时的峰面积，进而得到所述鹅膏毒肽的标样的进样量与峰面积之间的线性回归方程；步骤(2)和(3)中HPLC检测的条件相同；(4)根据步骤(2)中得到的峰面积与步骤(3)得到的线性回归方程，即得到蘑菇中鹅膏毒肽的含量。上述的方法中，步骤(1)中，所述甲醇提取的步骤如下：将干燥的所述蘑菇子实体粉碎后，采用甲醇水溶液进行提取；离心后取上清液。若为干子实体，选取采集的个体完整的子实体后，剔除泥沙杂物，于恒温干燥箱中70℃烘干至恒重，然后进行粉碎；若为新鲜子实体，选取采集的个体完整的子实体粉碎即可。上述的方法中，所述甲醇水溶液的体积百分含量可为50％。所述甲醇水溶液的用量为：1g所述蘑菇子实体：200mL甲醇水溶液；所述提取的条件如下：温度为30～37℃，时间为12～30h；离心后的沉淀再进行提取，然后将上清液合并。上述的方法中，所述方法还包括采用石油醚脱脂处理所述上清液的步骤；所述脱脂处理后的提取液经浓缩、定容后用0.22μm的微孔滤膜过滤。上述的方法中，步骤(2)和(3)中，所述HPLC检测的条件如下：高效液相色谱系统为岛津LC-20A；分析柱为YWGC18，5μm反相分析柱；二极管阵列检测器为SPD-M20A；检测波长为295nm；分析采用LCsolution软件；洗脱液由A液和B液组成，pH值为5.0；其中，A液由体积含量为10％的乙腈和90％的0.02mol/L的醋酸铵水溶液的混合液，B液为体积含量为24％的乙腈和76％的0.02mol/L的醋酸铵水溶液的混合液；洗脱梯度(为线性梯度洗脱)为：0～15min，A液的体积含量由100％调至95％，B液的体积含量由0％调至5％；15～35min，A液的体积含量由95％调至20％，B液的体积含量由5％调至80％，并保持5min；40～45min，A液的体积含量由20％调至0％，B液的体积含量由80％调至100％，并保持5min；50～55min，A液的体积含量由0％调制100％，B液的体积含量由100％调至0％，并保持10min；流动相流速为1.0mL/min；进样量为20μL。上述的方法中，步骤(3)中，可按照3μg、5μg、10μg、15μg、20μg的量进行进样；以面积、外标法分别获得各毒素的梯度进样量的峰面积数据，用最少二乘法求得各标样毒素的进样量与峰面积的线性回归方程。本专利技术采用HPLC方法检测分析了泰山致命鹅膏的子实体毒素状况，结果表明泰山致命鹅膏子实体含强毒害作用的鹅膏毒肽和鬼笔毒肽等10余种毒素物质，并且子实体个体间肽类毒素含量明显差异，其肽类毒素含量为1336～3627μg/g干重。此外，证实了子实体旺盛期肽类毒素含量最高，幼小蕾期次之，成熟衰老期最低。通过分析HPLC检测数据，发现致命鹅膏未煮的新鲜子实体鹅膏毒肽含量平均为157μg/g，煮过的子实体含量平均为21μg/g，前者高于后者7.5倍，为中毒患者的救治提供了重要的科学参考依据。附图说明图1为致命鹅膏不同生长阶段子实体的形态图，其中，图1(a)为菌蕾期的形态图，图1(b)为生长旺盛期的形态图，图1(c)为成熟期的形态图。图2为致命鹅膏子实体粗毒素(图2(a))及α-鹅膏毒肽标样的HPLC图谱(图2(b))。图3为鹅膏毒肽的紫外光谱图。图4为鬼笔毒肽的紫外光谱图。图5为泰山致命鹅膏子实体不同生长阶段毒素及α-鹅膏毒肽标样的HPLC图谱，其中，图5(a)为菌蕾期的HPLC图谱，图5(b)为生长旺盛期的HPLC图谱，图5(c)为成熟期的HPLC图谱，图5(d)为鹅膏毒肽标样的HPLC图谱。图6为致命鹅膏不同个体的粗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，包括如下步骤：(1)采用甲醇提取蘑菇子实体得到毒素提取液；(2)采用HPLC检测所述毒素提取液，得到鹅膏毒肽的吸收峰的峰面积；(3)采用鹅膏毒肽的标样配制标准溶液，然后采用HPLC检测所述标准溶液，得到不同进样量时的峰面积，进而得到所述鹅膏毒肽的标样的进样量与峰面积之间的线性回归方程；步骤(2)和(3)中HPLC检测的条件相同；(4)根据步骤(2)中得到的峰面积与步骤(3)得到的线性回归方程，即得到蘑菇中鹅膏毒肽的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，包括如下步骤：(1)采用甲醇提取蘑菇子实体得到毒素提取液；(2)采用HPLC检测所述毒素提取液，得到鹅膏毒肽的吸收峰的峰面积；(3)采用鹅膏毒肽的标样配制标准溶液，然后采用HPLC检测所述标准溶液，得到不同进样量时的峰面积，进而得到所述鹅膏毒肽的标样的进样量与峰面积之间的线性回归方程；步骤(2)和(3)中HPLC检测的条件相同；(4)根据步骤(2)中得到的峰面积与步骤(3)得到的线性回归方程，即得到蘑菇中鹅膏毒肽的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述甲醇提取的步骤如下：将干燥的所述蘑菇子实体粉碎后，采用甲醇水溶液进行提取；离心后取上清液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述甲醇水溶液的体积百分含量为50％；所述甲醇水溶液的用量为：1g所述蘑菇子实体：200mL甲醇水溶液；所述提取的条件如下：温度为30～37℃，时间为12～30h。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括采用石油醚脱脂处理所述上清液的步骤；所述脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张化榕，李壮，
申请(专利权)人：山东省泰安第二中学，山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37