去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，具体为：将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；然后加入等体积的提取液A，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合，涡旋混匀后得到混合液，将混合液离心，吸取上清液，然后加入等体积的三氯甲烷溶液，再次涡旋混匀后得到混合液，将混合液离心，吸取上层水相溶液，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量。本发明专利技术能有效地去除植物叶片总叶绿素对H2S含量测定的干扰，采用比色法测定植物叶片中H2S的含量，测定结果准确、可靠，操作简便、实用、快速、可操作性强，解决了现有技术中存在的问题。

【技术实现步骤摘要】
去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法
本专利技术属于生物测定
，涉及一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法。
技术介绍
植物体内低浓度的H2S是一种信号分子，参与调控植物气孔运动、增强光合作用、延缓衰老、促进植物的生长发育、缓解非生物胁迫等多种生理过程，而高浓度的H2S对植物细胞有毒害作用。植物内源H2S主要由半胱氨酸脱巯基酶催化半胱氨酸分解，以及亚硝酸盐还原酶催化的亚硝酸盐还原过程产生。植物在重金属胁迫、高温胁迫、盐胁迫下形成氧化胁迫，造成活性氧的累积，H2S通过调动抗氧化酶清除活性氧。同时，H2S是半胱氨酸合成的底物，在植物应对非生物胁迫中起着至关重要的作用。谷胱甘肽是以半胱氨酸为前体物合成的，参与活性氧的清除，同时也可以合成植物络合素而参与重金属解毒。5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)比色法(以下简称DTNB比色法)是最常用于测定植物组织(根系或者胚芽鞘)中H2S含量的一种方法。DTNB比色法通常用100mM的磷酸钾缓冲液(pH＝7.0，其中含10mMEDTA)来研磨植物的组织。磷酸钾缓冲液研磨植物根系后，研磨液呈显根系原色；加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液后，其与根系中的H2S反应生成黄色的硫硝基苯甲酸。由于叶片中叶绿素的存在，如果用该磷酸钾缓冲液研磨植物的叶片，研磨液会呈显绿色，加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液后仍为绿色，造成吸光值偏大，从而干扰植物叶片中H2S的含量测定。目前，除亚甲蓝法外，DTNB法是测定植物根系中H2S含量的最常用方法，没有发现测定植物叶片中H2S含量的相关文献。专利技术内容为了去除植物叶片中总叶绿素对H2S含量测定的干扰，本专利技术提供一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，能有效地去除总叶绿素对H2S测定的干扰，采用比色法测定植物叶片中H2S的含量，测定结果准确、可靠，操作简便、实用、快速、可操作性强，解决了现有技术中存在的问题。本专利技术所采用的技术方案是，一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，具体按照以下步骤进行：步骤S1，将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；步骤S2，吸取匀浆液，然后加入等体积的提取液A，涡旋混匀后得到混合液，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合得到；步骤S3，将步骤S2得到的混合液在4℃的条件下离心12-15min，离心速度为12000-14000r/min；步骤S4，吸取上清液，然后加入等体积的提取液B，涡旋混匀后得到混合液，提取液B为三氯甲烷溶液；步骤S5，将步骤S4得到的混合液在4℃的条件下离心3-4min，离心速度为10000-12000r/min；步骤S6，吸取上层水相溶液，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量，即得植物叶片中H2S含量。进一步的，所述步骤S6，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量的方法具体为：准确吸取2-3mL水相溶液，向溶液中加入等体积的反应液C，25℃下反应2min，用紫外分光光度计在412nm波长处测定吸光度值，反应液C为0.0317g5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶于200毫升研磨液中得到；式中，C：根据标准曲线拟合方程计算出所测样品吸光度值对应的H2S浓度，μmol/L；V1：步骤S1所用的研磨液体积，mL；V2：步骤S2吸取的匀浆液体积，mL；V3：步骤S6吸取的水相溶液体积，mL；Fw：步骤S1中植物叶片鲜重，g。进一步的，所述步骤S1中，研磨液为100mM磷酸钾缓冲液，磷酸钾缓冲液中含10mMEDTA。进一步的，所述研磨液的用量为：每0.15-0.20g植物叶片加入3.0-5.0mL研磨液。进一步的，所述步骤S2中，涡旋混合的混合速度为2800-3000r/min，混合时间为15-18s。进一步的，所述步骤S3中，离心时间为15min。进一步的，所述步骤S4中，涡旋混合的混合速度为2800-3000r/min，混合时间为15-18s。进一步的，所述步骤S5中，离心时间为3min。本专利技术的有益效果是，比色法测定植物叶片中H2S的含量易受叶片中总叶绿素的干扰，影响测定的准确性；本专利技术能有效地去除植物叶片总叶绿素对H2S含量测定的干扰，去除叶绿素干扰的效果好、稳定性强，能够准确测定植物叶片中H2S的含量；与色谱方法比较，本方法从样品提取、制备到测定具有简便、实用、快速、可操作性强等优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施案例1的水稻幼苗根部和叶片的H2S含量。图2是本专利技术实施案例2、3、4、5的水稻幼苗叶片的H2S含量。图3是本专利技术实施案例1、2、3、4、5的对照组水稻幼苗叶片的H2S含量。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术以丙酮(助溶剂)、正己烷(非极性提取剂)、三氯甲烷(极性提取剂)混合提取植物叶片中的总叶绿素，以此避免使用DTNB比色法时植物叶片中总叶绿素对H2S含量测定的干扰。叶绿素属酯类化合物，在有机溶剂中的溶解度远大于水中。根据叶绿素的极性，叶绿素在丙酮中的溶解度最大，其次是氯仿、正己烷、甲醇、乙醇。丙酮是目前最常见的植物叶片中总叶绿素(包括叶绿素a和叶绿素b)的提取剂，但是丙酮具有较强的水溶性，无法达到水相和有机相的分离。本专利技术的提取液A：丙酮与正己烷以体积比1：1混合，起到协同萃取和助溶的效果，该混合溶剂提取总叶绿素的效果比丙酮、正己烷单独提取效果好。提取液A中的正己烷(非极性提取剂)不溶于水，但叶绿素溶解于正己烷溶液中，加入丙酮起到助溶剂的作用，保证正己烷在水相中获得最大的分散相，以此达到总叶绿素在有机相中的溶解，便于充分萃取研磨液中的总叶绿素。提取液B：三氯甲烷溶液，为极性提取剂，在本文的作用是利用萃取剂的极性差异，把溶解于正己烷和丙酮混合液中的总叶绿素萃取到极性更大的有机相(三氯甲烷)中，以达到去除水相中总叶绿素的目的。本专利技术去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，具体按照以下步骤进行：步骤S1，称取0.15-0.20g(Fw,鲜重)水稻幼苗叶片在3.0-5.0mL(V1)、pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液，研磨液为100mM磷酸钾缓冲液，磷酸钾缓冲液中含10mMEDTA；植物叶片用100mM磷酸钾缓冲液研磨，主要是为了保证植物组织中的H2S含量的稳定；100mM磷酸钾缓冲液(含10mMEDTA)，即2.7843gK2HPO4·3H2O、1.0615gKH2PO4、0.1461gEDTA溶于200mL去离子水中；液研磨主要使水稻幼苗叶片研磨成匀浆液，同时维持溶液环境的pH，使H2S更稳定。H2S在酸性溶液中极易挥发，而在碱性条件下能被氧化成硫酸根。植物细胞液呈弱酸性，pH＝7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：步骤S1，将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；步骤S2，吸取匀浆液，然后加入等体积的提取液A，涡旋混匀后得到混合液，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合得到；步骤S3，将步骤S2得到的混合液在4℃的条件下离心12‑15min，离心速度为12000‑14000r/min；步骤S4，吸取上清液，然后加入等体积的提取液B，涡旋混匀后得到混合液，提取液B为三氯甲烷溶液；步骤S5，将步骤S4得到的混合液在4℃的条件下离心3‑4min，离心速度为10000‑12000r/min；步骤S6，吸取上层水相溶液，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量，即得植物叶片中H2S含量。

【技术特征摘要】
1.一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：步骤S1，将植物叶片在pH＝7.0的研磨液中冰浴研磨得到匀浆液；步骤S2，吸取匀浆液，然后加入等体积的提取液A，涡旋混匀后得到混合液，提取液A为丙酮和正己烷按照体积比1：1混合得到；步骤S3，将步骤S2得到的混合液在4℃的条件下离心12-15min，离心速度为12000-14000r/min；步骤S4，吸取上清液，然后加入等体积的提取液B，涡旋混匀后得到混合液，提取液B为三氯甲烷溶液；步骤S5，将步骤S4得到的混合液在4℃的条件下离心3-4min，离心速度为10000-12000r/min；步骤S6，吸取上层水相溶液，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量，即得植物叶片中H2S含量。2.根据权利要求1所述的一种去除植物叶片中总叶绿素干扰H2S含量测定的方法，其特征在于，所述步骤S6，采用比色法测定上层水相溶液中的H2S含量的方法具体为：准确吸取2-3mL水相溶液，向溶液中加入等体积的反应液C，25℃下反应2min，用紫外分光光度计在412nm波长处测定吸光度值，反应液C为0.0317g5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶于200毫升研磨液中得到；式中，C：根据标准曲线拟合方程计算出所测样品吸光度值对应的H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓章，林钰涓，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西,45