一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种溶菌酶分子印迹光子晶体膜，属于材料化学和分析检测领域。本发明专利技术将二氧化硅光子晶体微球与分子印迹技术结合，制备了具有反蛋白石结构的对三溶菌酶蛋白质分子特异性识别和结合的分子印迹光子晶体膜。随着结合的溶菌酶蛋白质分子数量增加，膜上的大孔结构发生变化，导致制备的分子印迹光子晶体膜的布拉格衍射波长红移。根据制备的分子印迹光子晶体凝胶膜对溶菌酶的光谱响应变化，本发明专利技术可以实现对样品中溶菌酶浓度的快速检测。该方法具有高灵敏度和选择性、低检出限的优点，可以作为一种生物传感器用于生物样品中溶菌酶蛋白质分子的快速检测。

A Molecularly Imprinted Photonic Crystal Membrane for Rapid Detection of Lysozyme and Its Preparation and Application

The invention relates to a lysozyme Molecularly Imprinted Photonic Crystal film, which belongs to the field of material chemistry and analysis and detection. The invention combines silica photonic crystal microspheres with molecular imprinting technology to prepare a molecularly imprinted photonic crystal film with anti-opal structure for specific recognition and binding of trilysozyme proteins. With the increase of the number of bound lysozyme proteins, the macroporous structure of the films changes, which results in the red shift of Bragg diffraction wavelength of the prepared Molecularly Imprinted Photonic Crystal films. According to the spectral response of the prepared Molecularly Imprinted Photonic Crystal gel membrane to lysozyme, the invention can quickly detect the concentration of lysozyme in the sample. The method has the advantages of high sensitivity, selectivity and low detection limit. It can be used as a biosensor for rapid detection of lysozyme proteins in biological samples.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜及其制备方法和应用
本专利技术属于材料化学和分析检测
，涉及一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜及其制备方法和应用，可用于生物传感及光学器件。
技术介绍
溶菌酶(Lysozyme)是一种分子量为14.3KDa，只含有129个氨基酸的单链小分子蛋白质。溶菌酶具有在人体中血清和体液溶菌酶水平异常与白血病、肾病、结膜炎、脑膜炎等多种疾病有关。溶菌酶在人体体内的含量具有重要的生理意义，已成为临床诊断中的一项重要临床指标。目前，溶菌酶检测方法的研究已经取得了很多成果，但仍存在样品预处理复杂、选择性低、耗时、成本等问题。因此，制备基于分子印迹光子晶体膜的生物传感器快速检测溶菌酶是一种优秀的解决办法。分子印迹技术(molecularlyimprintedtechnique,MIT)，是指以某一目标分子作为模板，利用单体与模板分子结合在交联剂的作用下，经过去除模板制备得到对目标分子具有特异选择性聚合物的技术。光子晶体是指由两种或两种以上具有不同介电常数(折射率)的材料在空间结构中按照一定的周期顺序排列所形成的具有有序结构的材料。光子晶体具有特有的布拉格衍射作用，它的布拉格衍射峰的波长受介质材料的折射率与晶格参数的影响，可以作为传感材料。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜及其制备方法和应用。本专利技术将分子印迹技术与光子晶体结合，通过氢氟酸刻蚀去除光子晶体模板，得到了溶菌酶分子印迹的反蛋白石结构光子晶体膜。本专利技术制备的溶菌酶分子印迹的光子晶体膜结合了两种技术的优点，当通过分子印迹作用特异结合模板溶菌酶时，会引起膜上孔穴结构变化，就能将分子的特异结合过程转换成可读的光学信号，从而达到检测目标分析物的目的。此外，在入射角一定的情况下，膜的衍射峰位置与其内部孔穴有关，当孔穴结构变化就会导致衍射峰的位移。膜上孔穴结合的溶菌酶分子越多，位移越明显，根据这一现象可以建立溶菌酶对衍射峰位移的方程，快速检测样品中的溶菌酶含量。本专利技术提供一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜的制备方法，包括以下步骤：(1)将硅片除杂并清洗，得到亲水化基质；(2)将单分散二氧化硅微球分散到无水乙醇中，形成胶体分散体系，将步骤(1)制备的亲水化基质以一定角度插入二氧化硅微球溶液中，采用垂直自组装的方法，恒温静置至乙醇完全挥发，得到光子晶体模板；(3)将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜清洗后覆盖在步骤(2)得到的光子晶体模板上；(4)依次将模板分子、功能单体和交联剂溶于磷酸盐缓冲溶液中，充分混合后得到预聚合溶液；(5)将引发剂和加速剂加入到步骤(4)的预聚合溶液中，分散后得到前驱体溶液；吸取一定量的前驱体溶液注入PMMA薄膜与硅片的缝隙中，直到溶液在毛细管和大气压的作用下充满PMMA和硅片之间的空隙，水浴聚合反应，得到溶菌酶分子印迹光子晶体膜；(6)将步骤(5)制备得到的溶菌酶分子印迹光子晶体膜浸泡于氢氟酸溶液中，去除二氧化硅微球，得到反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜；(7)将步骤(6)得到的反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜进行洗脱，直到完全除去溶菌酶模板蛋白质，制备得到的分子印迹光子晶体膜。作为优选，步骤(2)中，所述单分散二氧化硅微球的粒径为200～400nm；所述胶体分散体系中，单分散二氧化硅微球的质量份数为1.0～5.0％；所述角度为30-90°，所述恒温为在25-40℃下恒温。作为优选，步骤(4)中，所述模板分子为溶菌酶，功能单体为丙烯酰胺，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺；所述模板分子、功能单体和交联剂的重量比为：(10～200mg)：(50～500mg)：(50～500mg)；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0～8.0。作为优选，步骤(5)中，所述水浴聚合反应的条件为30℃水浴反应2.0～10.0小时；所述引发剂为过硫酸铵，加速剂为四甲基乙二胺，引发剂与加速剂的用量比为(5～50mg)：(5～50μL)。作为优选，步骤(6)中，在质量浓度0.5～5％的氢氟酸溶液中浸泡1～6小时。作为优选，步骤(7)中，所述洗脱时，洗脱液为十二烷基硫酸钠和乙酸的混合溶液；在混合溶液中，水为溶剂，十二烷基硫酸钠的质量浓度为1～10％，乙酸的体积浓度为1～15％。本专利技术还提供应用上述方法制备得到的分子印迹光子晶体膜。本专利技术还提供上述分子印迹光子晶体膜在快速检测溶菌酶中的应用。本专利技术还提供一种快速检测溶菌酶含量的方法，包括以下步骤：(1)将权利要求1-6任一项制备得到的分子印迹光子晶体膜分别放入不同浓度的溶菌酶标准溶液中，使其吸附饱和，取出分子印迹光子晶体膜，分别测定其紫外吸收光谱，计算得到吸收峰位移量-溶菌酶浓度变化曲线；(2)将权利要求1-6任一项制备得到的分子印迹光子晶体膜加入到待测样品中，通过测定溶菌酶分子印迹光子晶体膜的衍射峰波长变化，代入第一步得到的标准变化曲线，即可得到待测溶液中溶菌酶的含量。本专利技术提供一种快速定性检测待测溶液中是否含有溶菌酶的方法，其特征在于：是将权利要求1-6任一项制备得到的分子印迹光子晶体膜加入到待测样品中，使其吸附饱和，若在自然光下发生明显的红移，则待测溶液中含有溶菌酶，且含量大于0.5μmol/L。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术通过将单分散二氧化硅微球组装形成光子晶体，引入分子印迹聚合物，通过刻蚀后制备了具有形成三维有序的孔洞结构的分子印迹光子晶体膜。2.本专利技术制备的分子印迹光子晶体膜在去除模板后，可以快速再结合模板溶菌酶分子，并且结合后具有明显的衍射峰位移，根据这一现象实现对微量溶菌酶的快速检测。此外，当膜上溶菌酶分子结合量达到0.5μmol/L以上时，由于制备的分子印迹光子晶体膜衍射峰的位移，在自然光照射下，肉眼可见分子印迹膜会发生明显的红移(因为是不同尺寸的微球，变化从蓝到绿，绿到红，黄到红，都是红移)，根据这一点可以快速判断样品中是否有溶菌酶的存在，进一步降低了检测成本和操作要求。3.本专利技术的分子印迹光子晶体膜稳定性高，重复利用性好，操作方便，成本低廉，可作为一种理想的生物传感器用于生物样品中溶菌酶检测。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为实施例1中使用粒径为240nm二氧化硅微球制备的分子印迹光子晶体膜的紫外吸收峰。图2为实施例1步骤(7)制备的分子印迹光子晶体膜的扫描电镜照片。图3为分子印迹光子晶体膜置入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0μM的溶菌酶标准溶液后得到的紫外吸收峰位移量-溶菌酶浓度变化曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本专利技术的快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜的具体制备步骤如下：1)将1×10×75mm的硅片用去离子水超声清洗后，在piranha溶液(98％浓硫酸与30％双氧水的混合溶液，体积比7：3)中浸泡12小时处理除去表面杂质，之后用去离子水清洗干净，氮气吹干备用，得到亲水化基质；2)将粒径为200～400nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将硅片除杂并清洗，得到亲水化基质；(2)将单分散二氧化硅微球分散到无水乙醇中，形成胶体分散体系，将步骤(1)制备的亲水化基质以一定角度插入二氧化硅微球溶液中，采用垂直自组装的方法，恒温静置至乙醇完全挥发，得到光子晶体模板；(3)将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜清洗后覆盖在步骤(2)得到的光子晶体模板上；(4)依次将模板分子、功能单体和交联剂溶于磷酸盐缓冲溶液中，充分混合后得到预聚合溶液；(5)将引发剂和加速剂加入到步骤(4)的预聚合溶液中，分散后得到前驱体溶液；吸取一定量的前驱体溶液注入PMMA薄膜与硅片的缝隙中，直到溶液在毛细管和大气压的作用下充满PMMA和硅片之间的空隙，水浴聚合反应，得到溶菌酶分子印迹光子晶体膜；(6)将步骤(5)制备得到的溶菌酶分子印迹光子晶体膜浸泡于氢氟酸溶液中，去除二氧化硅微球，得到反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜；(7)将步骤(6)得到的反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜进行洗脱，直到完全除去溶菌酶模板蛋白质，制备得到的分子印迹光子晶体膜。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测溶菌酶的分子印迹光子晶体膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将硅片除杂并清洗，得到亲水化基质；(2)将单分散二氧化硅微球分散到无水乙醇中，形成胶体分散体系，将步骤(1)制备的亲水化基质以一定角度插入二氧化硅微球溶液中，采用垂直自组装的方法，恒温静置至乙醇完全挥发，得到光子晶体模板；(3)将聚甲基丙烯酸甲酯薄膜清洗后覆盖在步骤(2)得到的光子晶体模板上；(4)依次将模板分子、功能单体和交联剂溶于磷酸盐缓冲溶液中，充分混合后得到预聚合溶液；(5)将引发剂和加速剂加入到步骤(4)的预聚合溶液中，分散后得到前驱体溶液；吸取一定量的前驱体溶液注入PMMA薄膜与硅片的缝隙中，直到溶液在毛细管和大气压的作用下充满PMMA和硅片之间的空隙，水浴聚合反应，得到溶菌酶分子印迹光子晶体膜；(6)将步骤(5)制备得到的溶菌酶分子印迹光子晶体膜浸泡于氢氟酸溶液中，去除二氧化硅微球，得到反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜；(7)将步骤(6)得到的反蛋白石结构的分子印迹光子晶体水凝胶印迹膜进行洗脱，直到完全除去溶菌酶模板蛋白质，制备得到的分子印迹光子晶体膜。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述单分散二氧化硅微球的粒径为200～400nm；所述胶体分散体系中，单分散二氧化硅微球的质量份数为1.0～5.0％；所述角度为30-90°，所述恒温为在25-40℃下恒温。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述模板分子为溶菌酶，功能单体为丙烯酰胺，交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺；所述模板分子、功能单体和交联剂的重量比为：(10～200mg)：(50...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫，李彦松，张浩，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41