The invention relates to a method for preparing 10_hydroxy 2 2 decaenoic acid by using E. coli engineering bacteria. The steps are as follows: (1) construction of recombinant plasmid pBBB5K P450 fusion enzyme, recombinant plasmplasmplasmplasmplasmplasmid pBBB5K FadK, recombinant plasmplasmplasmplasmplasmplasmid pBB5K K MCAD, recombinant plasmid pBBBB5K YdiI; (2) construction of pBbb5K BydiI MCADAD MCADAD FadK fusion enzyme combination plasmid pBBBBB(3) Transforming Escherichia coli with fusion enzyme combination plasmid Induced cells were obtained by screening, induction and culture; (4) resting cells were obtained by transforming the induced cells into resting cells, then decanoic acid was added to the medium and cultured to produce 10 hydroxy 2 decanoic acid. The invention uses decanoic acid as raw material to ferment to produce 10 hydroxy 2 decanoic acid, realizing the process of producing 10 hydroxy 2 decanoic acid with low value decanoic acid and high added value.
【技术实现步骤摘要】
一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法
本专利技术涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵
技术介绍
10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoicacid，10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C10H18O3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。10-HDA的结构式如下：目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。但利用廉价的原料如癸酸发酵生产10-羟基-2-癸烯酸的相关技术未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌生产制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。本专利技术的技术方案如下：一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5...
【技术保护点】
1.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K‑P450融合酶、重组质粒pBbB5K‑FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K‑YdiI；所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；(2)利用步骤(1)制得的重组质粒pBbB5K‑P450融合酶、重组质粒pBbB5K‑FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K‑YdiI，构建pBbB5K‑ydiI‑MCAD‑FadK‑P450融合酶组合质粒；(3)取步骤(2)制得的pBbB5K‑ydiI‑MCAD‑FadK‑P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将步骤(3)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～1...
【技术特征摘要】
1.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；(2)利用步骤(1)制得的重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI，构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；(3)取步骤(2)制得的pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将步骤(3)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下培养，制得10-羟基-2-癸烯酸；所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：甘油0.8～1.2％,葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pBbB5K-P450融合酶，包括如下步骤：以经过密码子优化的水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)P450NADH还原酶的融合酶基因为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和P450NADH还原酶的融合酶基因分别用EcoRI和XhoI分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-P450融合酶；PCR扩增体系如下，总体系25μL：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μLphanta酶12.5μL，ddH2O9.5μL。PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.45min，循环30次；72℃延伸5min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pBbB5K-FadK，包括如下步骤：以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadK,上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA合成酶基因FadK分别用EcoRI和XhoI分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-FadK；PCR扩增体系如下，总体系25μL：100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μLphanta酶12.5μL，ddH2O9.5μL；PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒重组质粒pBbB5K–MCAD，包括如下步骤：以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA脱氢酶基因MCAD,上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，王瑞明，王芬，孙淑慧，汪俊卿，杨晓慧，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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