一种新型的鸡呼肠孤病毒株制造技术

本发明专利技术提供一种新型的鸡呼肠孤病毒株，为鸡呼肠孤病毒SD18株，于2019年2月20日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201910。本发明专利技术所筛选的病毒株用于制备疫苗。本发明专利技术通过对临床疑似呼肠孤病毒发病鸡群采集关节样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸡呼肠孤病毒变异毒株，经过RT‑PCR试验、病毒中和试验以及动物回归试验，确定所筛选的病毒为我国白羽肉鸡上流行的呼肠孤病毒的变异株，该变异株在血清学上与经典毒株有着显著地差异，为我国养禽场对该病的综合防控提供基础。

A New Chicken Reovirus Strain

The invention provides a new type of chicken reovirus strain, SD18 strain of chicken reovirus, which is stored in Wuhan China Typical Culture Preservation Center on February 20, 2019, and the storage number is CCTCC NO: V201910. The virus strains screened by the present invention are used for preparing vaccines. The invention separates, identifies and purifies the pathogen by collecting joint samples from chickens suspected to be infected with reovirus, and obtains a mutant strain of reovirus. After RT_PCR test, virus neutralization test and animal regression test, it is determined that the selected virus is a mutant strain of reovirus prevalent in white feather broilers in China, and the mutant strain is serologically tested. There are significant differences with classical strains, which provide a basis for comprehensive prevention and control of the disease in poultry farms in China.

【技术实现步骤摘要】
一种新型的鸡呼肠孤病毒株
本专利技术属于病毒筛选
，具体涉及一种新型的鸡呼肠孤病毒株。
技术介绍
鸡呼肠孤病毒(chickenreovirus,REO)又称“鸡病毒性关节炎”，各品种和日龄的鸡均可感染发病，其中以北方白羽肉鸡最为多见，该病不但可以水平传播，还可垂直传播，造成生产性能的极大降低，严重危害养鸡业的发展。禽呼肠孤病毒广泛存在并影响各种禽类，包括鸡、鸭，鹅，造成巨大的经济损失，特别是在肉鸡上造成病毒性关节炎、呼吸系统疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制和发育迟缓综合症等临床症状。呼肠孤病毒是一种分节段双链RNA病毒，病毒核酸不稳定，极易发生碱基突变、缺失或基因重组，从而导致新毒株的出现。近年来，我国北方不断的有呼肠孤病毒引起白羽肉鸡发病的报道，从这些免疫过经典毒株疫苗的鸡群中分离到了非经典呼肠孤病毒株，这些非经典呼肠孤病毒株与经典毒株在基因组结构和致病性上有较大差异，显示呼肠孤病毒可能已经发生了变异，出现了新的变异毒株，导致经典的呼肠孤病毒株疫苗低效或无效，鸡群大面积发病，生产效益损失严重，因此，加快呼肠孤病毒变异毒株的研究迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的鸡呼肠孤病毒株，该病毒株为一新型的鸡呼肠孤病毒，现有的鸡呼肠孤病毒典型毒株制备的疫苗对该病毒株的免疫效果不佳，因此所筛选的病毒株能够用于制备疫苗来提供全面的免疫保护。本专利技术所提供的鸡呼肠孤病毒株，为肉鸡呼肠孤病毒SD18株，已经于2019年2月20日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201910；本专利技术所筛选的病毒株用于制备疫苗。所述的疫苗为灭活疫苗。本专利技术再一个方面提供一种用肉鸡呼肠孤病毒SD18株作为抗原制备的疫苗。本专利技术通过对临床疑似呼肠孤病毒发病鸡群采集关节样本进行了病原的分离鉴定与纯化，得到了一株鸡呼肠孤病毒变异毒株，经过RT-PCR试验、病毒中和试验以及动物回归试验，确定所筛选的病毒为我国白羽肉鸡上流行的呼肠孤病毒的变异株，该变异株在血清学上与经典毒株有着显著地差异，为我国养禽场对该病的综合防控提供基础。附图说明图1：SD18株与参考毒株部分序列核苷酸比对图；图2：SD18株与参考毒株氨基酸部分序列比对图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的病毒株的筛选过程及理化性质进行详细的描述。实施例1：病毒株的分离过程2018年5月12日，接到山东聊城某白羽肉鸡企业送检的病鸡跗关节样品，打开跗关节、漏出关节腔和筋腱，用无菌棉棒蘸取其中的渗出液，并用剪刀剪取筋腱以及坏死组织，剪碎研磨，加入适当生理盐水，然后加双抗各1000U，反复冻融三次，5000rpm4℃离心15min，吸取上清液，0.22μm滤器过滤除菌。将上述滤液经绒毛尿囊膜接种SPF鸡胚10枚，接种量为0.2ml/枚。接种后置于37℃生化培养箱恒温孵化。弃掉24h以内死亡的鸡胚，连续观察7天，收获24h～168h死亡及未死的鸡胚绒毛尿囊膜，-80℃冻存备用。经绒毛尿囊膜初次传代的F1代鸡胚无明显可见变化，经第二、三代盲传后，鸡胚在接种后48h～120h陆续死亡，并且死亡时间随着传代次数的增加而稳定，基本在72h全部死亡。无菌打开鸡胚，尿囊膜增厚、苍白，将膜剥离，尿囊液中沉积大量的尿酸盐，胚体通红，肝脏有密集的出血斑，无菌收取尿囊膜和尿囊液，经检验无细菌污染和病毒无血凝活性，命名为SD18株，-80℃保存备用。所筛选的肉鸡呼肠孤病毒SD18株，已经于2019年2月20日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:V201910。实施例2：SD18株的鉴定一、PCR鉴定1、病毒RNA的提取及反转录在1.5ml离心管中加入300μl病毒绒毛膜研磨上清液，加入700μlTrizolReagentRNA提取液，混匀，室温放置15min。加入200μl氯仿，充分震荡混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，取上清液500μl转移至经DEPC处理的1.5ml离心管中。加入预冷的异丙醇500μl，-20℃静置30min后，12000rpm离心15min，弃掉上清。加入1ml75％乙醇，8000rpm离心5min，倒掉液体。倒置于纸上干燥，将沉淀悬于30μl的RNA-freewater中，-80℃保存备用。按照反转录酶使用说明书对提取的RNA进行反转录，将合成的cDNA于-20℃保存备用。2、PCR扩增采用25μlPCR反应体系：PremixTaq(TaKaRaTaqTMVersion2.0)12.5μl，上游引物P1：5'-GGTAACGTACATTGTCAAG-3'和下游引物P2：5'-GGGCACARTCGTAYTCACA-3'(均10μM)各1μl，cDNA模板2μl，ddH2O补加至25μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃40s，循环35次；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。3、PCR鉴定结果PCR反应结束后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果并拍照。电泳结果显示特异性目的片段大小为490bp，与预期片段大小相符。表明试验中分离到了鸡呼肠孤病毒，尿囊液HA试验均为0，表明不含有血凝性外源病毒污染(禽流感病毒、副黏病毒和腺病毒Ⅲ群)，RT-PCR对IBV、IBDV、FAV、CIAV、REV和ALV外源病毒检测证明鸡呼肠孤病毒中不含有其它外源病毒污染。二、全基因组序列测定及同源性分析从GenBank下载已知鸡源呼肠孤病毒分离株的序列，分析比对后，用Primer5.0软件设计呼肠孤病毒全基因组序列的引物，采用RT-PCR方法扩增各基因节段序列。根据测定的序列，为SD18株各基因节段的末端分别设计2条特异性下游引物，将接头引物作为上游引物，应用5'RACE(rapid-amplificationofcDNAends)技术，获得各基因节段的末端序列。通过核酸扩增、序列测定和拼接，获得了SD18株的全基因组序列。采用EasyPureQuickGelExtractionKit回收PCR产物，连接于pEASY-BluntCloningvector或pMD18-TVector(Promega)转化Trans-5α感受态细胞，经鉴定后测序。利用DNAMAN软件，预测各基因节段ORF的位置和数量，推导氨基酸序列，用BLASTn分析各基因编码情况。采用ClustalW1.8比对不同鸡源毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性，通过MEGA6.0构建进化树。将测得的肉鸡呼肠孤病毒BB18株10个基因片段分别于与GenBank上已发表的鸡呼肠孤病毒病毒序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。结果表明，鸡呼肠孤病毒编码的10个蛋白中，有7个蛋白(λA、λB、λC、μA、σA、σB、σNS)较为保守；有2个蛋白(μB、μNS)在核苷酸和氨基酸水平上相对保守，(表1、表2)。而决定鸡呼肠孤病毒抗原性的主要抗原基因S1及其编码的σC蛋白，其同源性分别在61.9％～64.6％和14.9％～32.0％之间，其比对图见1和图2。作为区分不同鸡呼肠孤病毒血清型毒株的重要参考，是区分鸡呼肠孤病毒经典株和变异株的依据，σC蛋白的序列表明本专利技术新分离的鸡呼肠孤病毒变异毒株SD18株处于一个独立的新进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡呼肠孤病毒株，其特征在于，所述的鸡呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCC NO:V201910。

【技术特征摘要】
1.一种鸡呼肠孤病毒株，其特征在于，所述的鸡呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCCNO:V201910。2.权利要求1所述的鸡呼肠孤病毒株在制备疫苗中的应用。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：杜元钊，张玉杰，刘东，刘红祥，范根成，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37