一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法技术

本发明专利技术属于曲司氯铵检测技术领域，公开了一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液；内标储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL

【技术实现步骤摘要】
一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法
本专利技术属于曲司氯铵检测
，具体涉及一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法。
技术介绍
曲司氯铵(trospiumchloride)是一种人工合成的具有4个铵基结构的托品酸衍生物，属于副交感神经的阻滞药，作用类似于阿托品，主要通过与内源性神经递质乙酰胆碱竞争性结合突触后膜M-受体而起作用，对有副交感神经支配的器官起着降低副交感神经张力、去除因副交感神经引起的平滑肌痉挛的作用，对胃肠、胆道和泌尿道也有一定作用。本品脂溶性低而不易通过血脑屏障，不会产生中枢神经系统副作用。曲司氯铵临床用于以下症状的治疗：尿频，夜尿症，非激素或器质病变所致膀胱功能紊乱(膀胱刺激、尿急)。和所有的季铵化合物一样，曲司氯铵有较强的水溶性，但口服吸收差，绝对生物利用度约为9.6％，进食后在此基础上继续下降约26％。药物吸收后约85％以原型经肾排泄，其余15％经肝代谢。较低的给药剂量和生物利用度，导致本品血药浓度低，常规分析方法不能满足生物样品的测定要求。目前，已经建立的生物样品中曲司氯铵测定方法有柱前衍生化HPLC结合荧光检测、放射免疫法和GC-MS，但这些方法的检测灵敏度尚需提高。为此，本专利技术提出一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，利用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法定量检测犬血浆中曲司氯铵的血药浓度，液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽及扫描快等优点，液相色谱串联质谱/质谱法已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，利用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法定量检测犬血浆中曲司氯铵的血药浓度，液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，且具有分辨率高、质量范围宽及扫描快等优点，该方法采用沉淀前处理、LC-MS/MS质谱仪进行测定，操作简单，分离效果好，定性准确，样品分析时间短，检测灵敏度高。本专利技术所采用的技术方案为：一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：称取曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL-1的曲司氯铵储备液，分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液，多个曲司氯铵工作溶液的浓度各不相同；称取曲司氯铵-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1～10mg·mL-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL-1的内标工作溶液；曲司氯铵工作溶液及内标工作溶液均在-20℃下保存，备用；(2)待测血浆样品前处理过程：取待测血浆样品，向待测血浆样品中加入步骤(1)的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图；(3)标准曲线的制作：等量取步骤(1)的多个曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得多个曲司氯铵校正标准溶液，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得一系列具有不同已知浓度的曲司氯铵校正标准溶液的色谱图，以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度的比值为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线，得回归方程Y＝a+bX；(4)待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度的计算：根据回归方程计算待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。进一步地，步骤(2)中的离心条件为：离心温度为4℃，离心速度为4000rpm，离心时间为10min。进一步地，按照步骤(1)中的曲司氯铵储备液的配制方式，平行配制另一份曲司氯铵储备液，将另一份曲司氯铵储备液分别稀释成浓度为300、200、20和3ng·mL-1的曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得四个质控样品，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得四个质控样品的色谱图。进一步地，液相色谱串联质谱/质谱测定过程的工作条件为：a.液相色谱条件：2.1×50mm的色谱柱；流动相A为0.1％甲酸和2mM乙酸铵的水溶液；流动相B为乙腈；柱温为30～50℃；流速为0.2～0.8mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式及多反应监测模式；电喷雾电压为4500～5500V；涡旋离子喷雾温度为500～600℃；气帘气的压力为30psi；雾化气的压力为50psi；辅助气的压力为55psi；数据收集时间为3～5min。进一步地，所述液相色谱条件还包括：自动进样器的清洗溶液为50％的甲醇水溶液；自动进样器的温度为8℃；自动进样器的清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器的洗针体积为500μL；自动进样器进样针清洗时的浸泡时间为1s；自动进样器的进样体积为20μL。进一步地，曲司氯铵在质谱条件中对应的监测离子对为392.0/164.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。进一步地，曲司氯铵-d8在质谱条件中对应的监测离子对为400.0/172.2，去簇电压为60V，碰撞能量为45eV。进一步地，步骤(3)中的曲司氯铵校正标准溶液的数量为8～10个，曲司氯铵校正标准溶液的浓度为0.05～20ng·mL-1。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术采用液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)法进行定性和定量测定，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；此外，本专利技术利用校正标样确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠；另外，本专利技术在比格犬血浆样品中加入乙腈沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高。(2)本专利技术利用随行质控样品确定标准曲线的准确性，利用标准曲线计算得四个质控样品对应的曲司氯铵的血药浓度，对比其实际浓度(理论值)，计算精密度，从而对曲司氯铵的血药浓度的准确度及精密度进行评价。(3)本专利技术的定量检测方法可应用于曲司氯铵的药物代谢动力学研究，为曲司氯铵的临床研究奠定技术基础，因此，本专利技术建立的曲司氯铵的液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)分析方法有助于服务制药企业，缩短其一致性评价的研究周期，高效严谨便捷准确地进行样品分析，有助于老百姓吃到安全、有效又便宜的药。附图说明图1是比格犬血浆中曲司氯铵浓度测定的代表性标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步阐释。本专利技术中需要的实验耗材与仪器分别为：a.分析天平：XP6百万分之一电子天平，METTLERTOLEDO(梅特勒-托利多)；b.离心机：型号为5810R的离心机，Eppendorf(艾本德)；c.超声清洗器：KQ-400DE超声波清洗器，来自于昆山市超声仪器有限公司；d.移液器：规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：称取曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL

【技术特征摘要】
1.一种血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：称取曲司氯铵至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL-1的曲司氯铵储备液，分别将所述曲司氯铵储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成多个曲司氯铵工作溶液，多个曲司氯铵工作溶液的浓度各不相同；称取曲司氯铵-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1～10mg·mL-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为10～20ng·mL-1的内标工作溶液；曲司氯铵工作溶液及内标工作溶液均在-20℃下保存，备用；(2)待测血浆样品前处理过程：取待测血浆样品，向待测血浆样品中加入步骤(1)的内标工作溶液，然后加入乙腈沉淀剂，涡旋混合，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得待测血浆样品对应的曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱图；(3)标准曲线的制作：等量取步骤(1)的多个曲司氯铵工作溶液，分别加入到空白血浆样品中，然后加入步骤(1)的内标工作溶液，再加入乙腈沉淀剂，涡旋混匀，离心取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀，分别得多个曲司氯铵校正标准溶液，进行液相色谱串联质谱/质谱测定，得一系列具有不同已知浓度的曲司氯铵校正标准溶液的色谱图，以曲司氯铵和曲司氯铵-d8的色谱峰面积比为纵坐标，以曲司氯铵的血药浓度与曲司氯铵-d8的血药浓度的比值为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归制作标准曲线，得回归方程Y＝a+bX；(4)待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度的计算：根据回归方程计算待测血浆样品中的曲司氯铵的血药浓度。2.根据权利要求1所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：步骤(2)中的离心条件为：离心温度为4℃，离心速度为4000rpm，离心时间为10min。3.根据权利要求1所述的血浆中曲司氯铵的定量检测方法，其特征在于：按照步骤(1)中的曲司氯铵储备液的配制方式，平行配制另一份曲司氯铵储备液，将另...

【专利技术属性】
技术研发人员：李高，张媛，
申请(专利权)人：康诚科瑞医药研发武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42