检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的检测还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的试剂盒。本发明专利技术的检测方法和试剂盒操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。

【技术实现步骤摘要】
检测还原型谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽的方法
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术的检测还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，还涉及用于检测GSH和/或GSSG的试剂盒。
技术介绍
谷胱甘肽分为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，其中GSH的化学名称为N-(N-L-γ-谷氨酰基-L-半胱氨酰基)甘氨酸，是细胞内含量最高的非蛋白巯基化合物，具有抗氧化、调节免疫应答、抵御外源性毒物等重要生理功能。GSH和GSSG组成了细胞内最重要的氧化还原系统之一，它们的比值GSH/GSSG是氧化应激的重要指标，该比值通常保持在一个相对稳定的范围内，但在异常生理条件下可能会发生改变。除了作为抗氧化剂，在细胞受到外源性毒物沾染时，GSH还可以通过直接或酶促的方式与亲电试剂如卤代烷烃、环氧化合物、重金属离子等发生加合反应保护细胞，降低损伤。因此，细胞内GSH和GSSG的含量检测可作为筛查GSH耗竭事件的重要指标。目前已有许多针对细胞中GSH和GSSG含量检测试剂盒，多为基于酶循环方法和紫外-可见光吸收光谱(Ultraviolet–visiblespectroscopy，UV-Vis)的分析检测，通常能达到μM或nM的高灵敏度，但是其操作步骤较为繁琐和耗时、成本较高。因此目前仍然需要开发快速、简单、灵敏且能够同时检测细胞GSH和GSSG的产品，以实现对GSH耗竭事件的快速筛查确证。表面增强拉曼光谱(Surface-EnhancedRamanSpectroscopy，简称SERS)技术是一种指纹光谱技术，具有分辨率高、实时分析、无损检测、无需复杂的样品预处理、适合痕量分析等独特的优势。目前，已有针对细胞中谷胱甘肽的SERS检测方法，包括直接法和间接法两种，其中直接检测法受GSH和GSSG分子极化率低的影响，灵敏度很低；间接检测法的操作复杂耗时，难以广泛应用。
技术实现思路
本专利技术利用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))与GSH迅速发生氧化还原反应生成TNB，将TNB作为高活性SERS探针，以原位还原法制备的固态纳米银基底作为SERS固态增强基底，成功区分DTNB和TNB信号，从而实现了GSH的间接检测；对于GSSG，本专利技术首先用N-乙基马来酰亚胺(NEM)将GSH中的巯基掩蔽，然后用还原剂NaBH4将GSSG还原为GSH，然后再对GSH进行检测。本专利技术所建立的检测方法操作简便、检测速度快和灵敏度高，可以很好地应用于烷基化试剂染毒细胞样品中GSH和GSSG含量的测定，从而实现烷基化试剂快速筛查检测。本专利技术的第一方面涉及一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。在某些实施方案中，本专利技术第一方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。本专利技术的第二方面涉及本专利技术第一方面所述的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。本专利技术的第三方面涉及一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，N-乙基马来酰亚胺(NEM)，硼氢化钠，和乙酸。在某些实施方案中，本专利技术第三方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。本专利技术的第四方面涉及本专利技术第三方面所述的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。本专利技术的第五方面涉及一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，和硼氢化钠。在某些实施方案中，本专利技术第五方面所述的试剂盒中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。本专利技术的第六方面涉及本专利技术第五方面所述的试剂盒用于检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。本专利技术的第七方面涉及一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，孵育；将孵育后的溶液滴加到SERS固态增强基底，干燥，采集SERS图谱；可选地，判断样品中是否存在GSH，若SERS图谱在波数为约1066cm-1、约1338cm-1和/或约1558cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；优选若SERS图谱在波数为约1338cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；可选地，利用特征峰的强度对样品中的GSH进行定量。在某些实施方案终，本专利技术第七方面涉及的检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，其中孵育在15～40℃(例如15～37℃，15～25℃，20～30℃)下进行，优选孵育1～15分钟(例如5～10分钟，8～12分钟)。本专利技术的第八方面涉及一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入硼氢化钠，将GSSG还原为还原型谷胱甘肽(GSH)；可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用本专利技术第七方面所述的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。本专利技术第九方面涉及一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)，掩蔽样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基，加入硼氢化钠，将GSSG还原为GSH，可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用本专利技术第七方面所述的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。在某些实施方案终，本专利技术第八或第九方面涉及的检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，其中向待测溶液中加入硼氢化钠后，于40～55℃(例如48～52℃，45～50℃)下反应8～15分钟(例如10分钟，12分钟)。在某些实施方案终，本专利技术第八或第九方面涉及的检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，其中加入乙酸的量能够除去过量的硼氢化钠即可。本专利技术的第十方面涉及一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值的方法，包括以下操作：采用本专利技术第七方面所述的检测方法检测样品中GSH的含量，采用本专利技术第九方面所述的检测方法检测样品中GSSH的含量，计算GSH和GSSH的比值。在某些实施方案中，本专利技术的第七至十方面涉及的检测方法，所述样品为细胞，其检测流程如图1所示。在某些实施方案中，本专利技术所述的SERS固态增强基底为固态纳米银基底。所述固态纳米银基底可以为原位还原法制备得到的固态纳米银基底，也可以是组装法制备得到的固态银纳米基底。在某些实施方案中，所述原位还原法包括以下操作：将单晶硅片置于浓硫酸与双氧水的混合液中，加热，将加热本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，和5,5'‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸)(DTNB)，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。2.权利要求1的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。3.权利要求1或2的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的用途。4.一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，N-乙基马来酰亚胺(NEM)，硼氢化钠，和乙酸，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。5.权利要求4的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。6.权利要求4或5的试剂盒用于检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和/或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。7.一种试剂盒，包括：SERS固态增强基底，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，和硼氢化钠，优选地，所述SERS固态增强基底为固态纳米银基底。8.权利要求7的试剂盒，其中还包括：PB缓冲溶液或配制PB缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠)，和/或PBS缓冲溶液或配制PBS缓冲溶液的缓冲物质(包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠)，可选地，所述试剂盒还包括说明书。9.权利要求7或8的试剂盒用于检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的用途。10.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，孵育；将孵育后的溶液滴加到SERS固态增强基底，干燥，采集SERS图谱；可选地，判断样品中是否存在GSH，若SERS图谱在波数为约1066cm-1、约1338cm-1和/或约1558cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；优选若SERS图谱在波数为约1338cm-1处出现特征峰，确定样品中存在GSH；可选地，利用特征峰的强度对样品中的GSH进行定量。11.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入硼氢化钠，将GSSG还原为还原型谷胱甘肽(GSH)；可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用权利要求10的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。12.一种检测样品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)的方法，包括以下操作：向待测溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)，掩蔽样品中还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基，加入硼氢化钠，将GSSG还原为GSH，可选地，向加入乙酸，除去过量的硼氢化钠，采用权利要求10的检测方法检测GSH，可选地，根据GSH的检测结果，判断样品中是否存在GSSH和/或计算样品中GSSH的含量。13.一种检测样品中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值的方法，包括以下操作：采用权利要求10的检测方法检测样品中GSH的含量，采用权利要求12的检测方法检测样品中GSSH的含量，计算GSH和GSSH的比值。14.权利要求1、2、4、5、7、8中任一项的试剂盒或权利要求10-13中任一项的检测方法，其中所述固态纳米银基底为原位还原法制备得到的固态纳米银基底，优选地，所述原位还原法包括以下操作：将单晶硅片置于浓硫酸与双氧水的混合液中，加热，将加热后的单晶硅片用水(例如超纯水)冲洗，干燥，将干燥的单晶硅片置于HF溶液中浸泡，取出放入AgNO3和HF的混合溶液中，反应，得到固态纳米银基底，可选地，将固态纳米银基底用水(例如超纯水)冲洗，干燥，可选地，将固态纳米银基底固定于载玻片，可选地，将固态纳米银基底真空储存，优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴剑峰，朱颖洁，高中才，徐华，郭磊，谢剑炜，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11