一种用于处理高盐废水的复合菌种制造技术

本发明专利技术提供一种用于处理高盐废水的复合菌种，具体地，所述方法包括向特定微生物内转入嗜盐相关基因，本发明专利技术获得的嗜盐细菌加入到深度生化池后，深度生化池中本底污泥中的微生物生活并未收到影响，本发明专利技术提供的嗜盐细菌对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对可生化性较差的污水具有处理功能，单菌性能稳定，通过基因改造使得其性能可传代，尤其适用于有深度污水处理需求的工业场景。

A Composite Strain for Treatment of High Salt Wastewater

The invention provides a composite strain for treating high-salt wastewater. Specifically, the method includes transferring halophilic related genes into specific microorganisms. After the halophilic bacteria obtained by the invention are added to the deep biochemical pond, the microbial life in the background sludge of the deep biochemical pond has not been affected. The halophilic bacteria provided by the invention are tolerant to high-salt, High-chlorine and high-alkali wastewater. It has good biodegradability and biodegradability, and can treat wastewater with poor biodegradability. Single bacteria have stable performance. Through genetic modification, its performance can be passed on, especially for industrial scenarios with deep wastewater treatment needs.

【技术实现步骤摘要】
一种用于处理高盐废水的复合菌种
本专利技术涉及污水处理领域，特别地涉及一种用于处理高盐废水的复合菌种。
技术介绍
近年来，随着我国工业产业蓬勃发展，工业污水排放量迅速提高，随着化学合成工艺的多样化发展，工业污水中新增了大部分高盐、高氯污水，这些污水毒性较大，对微生物生长有抑制或毒害作用，大量标污水的排放势必会对周边环境和受纳水体产生污染，危及周边海域，从而对人类生活和生产造成严重威胁和影响。生物强化技术属于生物处理技术，生物强化技术是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果，投加后的微生物可以来源于原有的处理体系。国内外研究者已把这项技术应用于工业废水、地表水及地下水中难降解有毒有害物质的治理或用于改善废水处理效果，可显著提高微生物活性，提高高盐污水处理效率。但在生物强化技术使用过程中，如何充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物的处理效果，如何抑制高盐高氯污水对于微生物的细胞毒性，是这一技术在工业生产中亟待解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于处理高盐废水的复合菌种。本专利技术是以如下技术方案实现的：一种用于处理高盐废水的复合菌种，所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌。优选地，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％。进一步地，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。进一步地，所述芽孢杆菌的获得具体步骤为：步骤一、获得高盐环境中总嗜盐基因；步骤二、构建嗜盐基因文库；步骤三、初步筛选获得潜在嗜盐基因；步骤四、将初步筛选获得的潜在嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌；步骤五、获得转基因枯草芽孢杆菌，评估转基因枯草芽孢杆菌的耐盐能力。进一步地，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的任一条序列。进一步地，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括如SEQIDNO:2所示核苷酸序列。进一步地，所述复合菌种对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性。进一步地，所述微生物复合菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂内活菌计数不低于2.8×107cfu/mL。进一步地，所述微生物复合菌剂为干粉菌剂，所述干粉菌剂内活菌计数不低于1.2×108cfu/g。进一步地，所述复合菌剂为胶囊，所述胶囊内活菌计数不低于5×109cfu每胶囊。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术获得转基因枯草芽孢杆菌加入到深度生化池后，深度生化池中本底污泥中的微生物生活并未收到影响，经过1个月的中试试验，证实本专利技术提供的转基因枯草芽孢杆菌对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对上述可生化性较差的污水具有处理功能，单菌性能稳定，通过基因改造使得其性能可传代，尤其适用于有深度污水处理需求的工业场景。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术作进一步地详细描述，以下试剂或菌剂若无特殊说明，均为市售试剂或菌剂。实施例1：复合菌种的制备所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌，优选地，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％，更优选地，所述芽孢杆菌为转基因芽孢杆菌，所述复合菌剂可以制备成液体菌剂、干粉菌剂、胶囊等类型，制备成液体菌剂时，所述液体菌剂内活菌计数不低于2.8×107cfu/mL；制备成干粉菌剂时，所述干粉菌剂内活菌计数不低于1.2×108cfu/g；制备成胶囊时，所述胶囊内活菌计数不低于5×109cfu每胶囊。实施例2：总嗜盐基因的获得盐碱湖是自然界高盐碱环境，大多为内陆湖泊，可以形成较封闭的微生物生态环境，盐碱湖微生物群落包含藻类、蓝细菌、好氧细菌、厌氧细菌、兼性好氧细菌、古菌等，古菌是盐碱湖微生物群落的重要组成成分，它们适应高盐碱环境，大多属于化能有机营养类型，由于嗜盐古菌具有区别于其他微生物的渗透压、细胞膜离子分布、嗜盐程度、贫养等特性，在常规条件下很难培养，正是由于古菌具备上述理化性质上的特异性，其有区别于常规微生物的代谢途径，具备应用于工业产业中的潜力，故本专利技术采用非培养技术探究盐碱湖内包括古菌在内的微生物遗传多样性，获取微生物，特别是古菌的嗜盐相关基因。样品采集自中国，艾丁湖，样品种类包括湖周泥土、湖面盐壳、水样、湖底泥，采集样品后于0℃保藏。艾丁湖年降水量不到20毫米，年平均气温14℃，极端高温达48℃，地表温度超过80℃。将上述湖周泥土、湖面盐壳、水样、湖底泥样品混合，取25g混合样品与50mL缓冲液混合加入透析袋，透析12h去除样品中的盐离子，拖延后采取冻融法裂解细胞并提取微生物总DNA，纯化DNA样品。实施例3：构建嗜盐基因文库将纯化获得的DNA进行测序并利用大肠杆菌表达系统(E.coliDH5a)构建盐湖嗜盐基因文库，随机打断基因组DNA至100bp、150bp、200bp、250bp、500bp、1.0kb、1.5kb、2.5kb的片段，将DNA片段与接头连接之后PCR扩增100bp、150bp、200bp、250bp、500bp序列并上机测序获得短序列文库，1.0kb和1.5kb大片段文库采用Cre-Lox建库技术构建，在DNA大片段两端连接LoxP接头后再进行环化、测序；按照基因组构建步骤分别构建插入片段为250bp，500bp，1.0kb，1.5kb的片段插入文库，基因组测序委托南京金斯瑞公司通过SOLEXA测序平台完成。将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，盐胁迫浓度为15％-20％(NaCl浓度按1％递增)和20％-30％(NaCl浓度按2％递增)，于35℃培养一周，挑取盐浓度25％时生长旺盛的菌落进行纯培养(划线培养，盐浓度为0.25g/L的LB培养基)，挑取20个长势旺盛的克隆进行测序，用通用引物T7F和pYES2R，古菌特异性引物25F和915R分别测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得嗜盐基因SAL1、SAL2、SAL3、SAL4、SAL5、SAL6，经BLAST比对，SAL1、SAL5、SAL6与嗜盐古菌超氧化物歧化酶编码基因具有同源性，选择SAL1、SAL5、SAL6基因对环境适应性较强的芽孢杆菌进行基因改造。实施例4：将嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌中对SAL1、SAL5、SAL6进行密码子改造，使其适应枯草芽孢杆菌编码系统，获得改造后的基因SAL1c核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，SAL5c核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，SAL6c核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所述SAL1c、SAL5c、SAL6c的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列5’端还连接有NcoI酶切位点，3’端还连接有SwaI酶切位点。将合成的SAL1c、SAL5c、SAL6c核苷酸序列分别连入克隆载体pGEM-T(购自Promega)上，操作步骤按载体说明书进行，得到重组克隆载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于处理高盐废水的复合菌种，其特征在于，所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌。

【技术特征摘要】
1.一种用于处理高盐废水的复合菌种，其特征在于，所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌。2.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％。3.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述芽孢杆菌的获得具体步骤为：步骤一、获得高盐环境中总嗜盐基因；步骤二、构建嗜盐基因文库；步骤三、初步筛选获得潜在嗜盐基因；步骤四、将初步筛选获得的潜在嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌；步骤五、获得转基因枯草芽孢杆菌，评估转基因枯草芽孢杆菌的耐盐能...

【专利技术属性】
技术研发人员：周春松，周佳玮，贾建洪，王浩，孙坚，
申请(专利权)人：宜兴国际环保城科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32