甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND的功能及应用制造技术

本发明专利技术属于油菜分子育种技术领域，公开了一个甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND的功能及应用，该基因两个同源拷贝在油菜角果开裂过程中存在部分冗余的功能，且BnA03.IND拷贝较BnC03.IND拷贝在角果开裂过程中所起的作用更大；序列比较分析发现BnIND基因的两个拷贝编码具有相同功能的蛋白，而启动子区域具有较大的序列变异；由于启动子区域的序列差异导致BnIND基因的两个拷贝出现了基因表达量上的差异，最终导致BnA03.IND拷贝较BnC03.IND拷贝在油菜角果开裂过程中发挥更大的作用。本发明专利技术为油菜抗裂角性状的遗传改良提供重要的功能基因和育种材料。

Function and Application of Crack Angle Resistance Gene BnIND in Brassica napus

The invention belongs to the field of rapeseed molecular breeding technology, and discloses the function and application of a crack-resistant gene BnIND of Brassica napus. The two homologous copies of the gene have partial redundant functions in the cracking process of rapeseed horn fruit, and the role of BnA03.IND copy in the cracking process of horn fruit is greater than that of BnC03.IND copy; sequence comparison analysis shows that two copies of BnIND gene have coding tools. Protein with the same function, but the promoter region has a large sequence variation. Because of the sequence difference of promoter region, the two copies of BnIND gene show differences in gene expression, which eventually leads to BnA03.IND copies play a greater role in the process of rape pod cracking than BnC03.IND copies. The invention provides important functional genes and breeding materials for genetic improvement of rape crack resistance.

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND的功能及应用
本专利技术属于油菜分子育种领域，涉及一个甘蓝型油菜基因BnIND在角果抗裂方面的功能及应用。
技术介绍
成熟角果的开裂是油菜在长期进化过程中为了适应环境、繁衍后代而形成的一种生物学特性。但是角果的易开裂性在油菜生产中是不利性状，会导致油菜减产，也不利于机械化收获的推广应用。据统计，每年由此产生的产量损失一般占总产量的约20％，在恶劣天气条件下高达50％(Price等，1996；Child等，1998)。因此，开发适合机械化收获的抗裂角油菜品种将带来显著的经济效益。在包括拟南芥和油菜在内的十字花科(Brassicaceae)植物中，角果的开裂是由一些特化细胞在两个果瓣间发育成离层区所致。离层区由木质化层和分离层所组成；在角果成熟时，木质化层变硬、同时分离层分泌水解酶导致其抗裂强度降低，它们的共同作用导致了角果从离层开裂。在拟南芥中，与角果开裂相关的基因及其调控网络也有大量的研究。其中，两个功能冗余的MADS-box基因SHATTERPROOF1(SHP1)和SHP2参与果瓣边缘的发育(Liljegren等，2000)；它们调控下游INDEHISCENT(IND)基因的表达。这些基因的功能缺失突变体都不能形成正常的果瓣边缘，导致角果不能开裂，种子无法散出。甘蓝型油菜的角果发育与拟南芥十分相似，因此拟南芥中的抗裂机制研究为油菜中的相关研究提供了丰富的信息。甘蓝型油菜是一种异源四倍体物种，是由两个二倍体祖先种白菜(B.rapa，AA基因组)和甘蓝(B.oleracea，CC基因组)天然杂交后进化而来(Chalhoub等，2014)。甘蓝型油菜的角果容易开裂，传统的方法主要通过种间杂交引入近缘种中的抗裂基因提高抗性(Prakash和Chopra1988；Morgan等，1998；Summers等，2003)。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术的方法耗时较长，也会同时引入其它一些不利的农艺性状，使得它们不适合栽培应用(Summers等，2003)。与种间杂交法相比，通过遗传转化可以快速有效地将拟南芥中的抗裂基因导入到优良的品种中，并已经成功地运用于芸薹属作物中角果抗裂的遗传改良(Chandler等，2005；等，2006)，但是该方法目前在很多国家和地区受到转基因政策的限制。除了种间杂交和转基因外，还可以通过诱变产生新的遗传变异来改良抗裂角性。例如，Braatz等(2018)通过EMS诱变获得了抗裂角突变体，并证实仅在ind双拷贝的突变体中抗裂角性增加，表明该基因的两个拷贝具有功能保守和冗余的特征。然而，随机诱变还会导致大量的背景突变并对其它性状产生不利影响。例如ind的两种随机诱变的单突变体育性都极显著降低(Braatz等，2018)。在甘蓝型油菜中进行随机诱变的另一个主要缺陷在于其多倍体的特性导致大多数基因具有多个功能相似的同源拷贝，而随机诱变通常只能随机突变其中之一，因此一般都不会产生明显的表型。解决上述技术问题的意义：近年来，CRISPR/Cas9作为一种高效的定点靶向基因编辑技术已经成功地运用于油菜中。本专利技术利用CRISPR/Cas9技术靶向BnIND同源基因，通过遗传转化得到突变体单株，经过多代自交分离，最后获得了单拷贝纯合和双拷贝纯合的突变体，并对这些突变体表型鉴定，遗传分析及抗裂角性测量。研究结果表明，BnIND基因的双拷贝突变体和单个BnA03.IND拷贝突变的纯合突变体可以产生抗裂角性显著增加的角果。BnIND基因对于油菜角果开裂性状的改良具有巨大的应用潜力和前景，为油菜产量育种提供新的基因资源。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种甘蓝型油菜基因BnIND在角果抗裂方面的功能及应用，同时提供一种利用基因编辑技术鉴定甘蓝型油菜BnIND基因的两个同源拷贝在角果抗裂方面的功能。本专利技术靶向甘蓝型油菜BnIND基因的两个同源拷贝，快速高效的获得了能稳定遗传的抗裂角表型明显的甘蓝型油菜种质资源，对抗裂角甘蓝型油菜的选育具有重要的意义。该突变体不含有T-DNA插入，和野生型相比，抗裂角指数达到了极显著水平。本专利技术是这样实现的，一种甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND，所述甘蓝型油菜抗裂角候选基因BnIND核苷酸序列为SEQIDNO：12、SEQIDNO：13。本专利技术的另一目的在于提供一种所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为：SEQIDNO：24、SEQIDNO：25。本专利技术的另一目的在于提供一种分离所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND的控制甘蓝型油菜抗裂角的启动子，所述序列启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：26、SEQIDNO：27。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND进行突变的双突变体，所述双突变体由BnIND的两个拷贝同时发生基因编码区内的核苷酸序列突变，含有所述突变的植株具有抗裂角性状，突变后产生抗裂角表型的双突变体核苷酸序列为：SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22及SEQIDNO：23。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND进行突变的单突变，所述单突变由BnIND的单个拷贝发生基因编码区内的核苷酸序列突变，含有突变后核苷酸序列的植株具有抗裂角性状，突变后产生抗裂角表型的单突变核苷酸序列为SEQIDNO：28。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述的双突变在育种中的应用。本专利技术的另一目的在于提供种利用所述的单突变在育种中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND在甘蓝型油菜抗裂角性状改良种的应用。在本专利技术中，甘蓝型油菜抗裂角候选基因BnIND，核苷酸序列表如序列为：>BnA03.INDATGTCTGGCTCAAAAGCAGATGCAGCCATAGCCCCAATAGTCATGATGGAGCATCATCATCTCCTTATGAATTGGAACAAACCTATTGATCTCATTACAGAAGAAAACTCTTTTAACCACAATCCTCATTTCATAGTAGATCCACCTTCCGAAACCCTAAGCCACTTCCAGCCCCCGCCGACAATCTTCTCCGATCACGGAGGAGGAGAGGAAGCAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGAGAGGAAGAGATGGATCCGATGAAGAAGATGCAATACGCGATTGCTGCCATGCAGCCCGTAGACCTCGATCCAGCCACCGTTCCTAAGCCGAACCGCCGTAACGTAAGGGTAAGCGACGACCCTCAGACGGTGGTGGCTCGTCGGCGTAGAGAAAGGATAAGCGAGAAGATCCGGATATTGAAGAGGATGGTGCCAGGCGGTGCAAAGATGGACACTGCCTCCATGCTCGACGAAGCCATCCGCTACACCAAGTTCTTGAAACGGCAGGTGAGGCTAGCTTCTTCAGCCTCACACTCAGCTTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND，其特征在于，所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND核苷酸序列为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13。

【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND，其特征在于，所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND核苷酸序列为SEQIDNO：12、SEQIDNO：13。2.一种如权利要求1所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为：SEQIDNO：24、SEQIDNO：25。3.一种分离权利要求1要求所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND的控制甘蓝型油菜抗裂角的启动子，其特征在于，所述序列启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：26、SEQIDNO：27。4.一种利用权利要求1所述甘蓝型油菜抗裂角基因BnIND进行突变的双突变体，其特征在于，所述双突变体由BnIND的两个拷贝同时发生基因编码区内的核苷酸序列突变，含有所述突变的植株具有抗裂角性状，突变后产生抗裂角表型的双突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：范楚川，周永明，翟云孤，蔡胜利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42