一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体公开了一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白及其编码基因与应用。所述EAR1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该基因的突变体ear1在干旱处理下生长明显好于野生型，且失水率低于野生型，说明突变体的抗旱性显著提高。本发明专利技术发现了拟南芥EAR1基因编码的功能蛋白，可通过与PP2C直接互作来增强PP2C的活性，负调节ABA信号途径，在双子叶和单子叶植物中具有序列保守性。拟南芥作为模式植物，生长周期短、基因组小且已测序完成、遗传操作简单，通过农杆菌侵染花序的方法，可以获得抗旱的过表达植株或基因编辑突变体，为品种改良提供基因资源。

An EAR1 Protein Related to Drought Resistance in Plants and Its Coding Gene and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering, and specifically discloses an EAR1 protein related to plant drought resistance and its coding gene and application. The amino acid sequence of the EAR1 protein is shown in SEQ ID No.1 and the nucleotide sequence of the coding gene is shown in SEQ ID No.2. The mutant ear1 grew better than the wild type under drought treatment, and its water loss rate was lower than that of the wild type, indicating that the drought resistance of the mutant was significantly improved. The functional protein encoded by the EAR1 gene of Arabidopsis thaliana has been found. The activity of PP2C can be enhanced by direct interaction with PP2C, and the ABA signal pathway can be negatively regulated. It has sequence conservativeness in dicotyledons and monocotyledons. As a model plant, Arabidopsis thaliana has a short growth cycle, small genome, complete sequencing and simple genetic manipulation. By infecting inflorescence with Agrobacterium tumefaciens, drought-resistant overexpression plants or gene editing mutants can be obtained, which can provide genetic resources for variety improvement.

【技术实现步骤摘要】
一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白及其编码基因与应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
干旱、高温、低温、高盐等非生物逆境胁迫严重影响植物生长发育，导致作物产量下降。随着全球气候变化，干旱问题日益严重。干旱、半干旱耕地面积占世界总耕地面积的43％，我国更是达到全国总耕地面积的52％。干旱是制约农业生产的世界性难题，其造成的农作物损失在非生物胁迫中居首位，仅次于生物胁迫中病虫害造成的损失。尽管一些植物已经进化出适应干旱胁迫的机制，但多数重要农作物仍然对干旱比较敏感，因此培育抗旱新品种是应对旱胁迫减产的有效途径之一。传统育种方式尽管安全、稳定，但周期长，存在一定的不可预测性。逐步发展起来的分子育种能够显著提高育种效率，具有很强的定向性。利用现代分子生物学技术和基因工程手段，从生理生化和分子水平上研究植物响应干旱胁迫的机制，寻找植物响应干旱的重要基因，能够为抗旱品种的培育和改良提供重要的理论依据，对提高干旱胁迫下作物产量具有实用价值。利用基因敲除、转基因过表达等分子生物学技术和基因工程手段，研究基因功能，获得与抗旱相关的基因和抗旱种质资源，通过培育抗旱新品种，提高作物在干旱条件下的产量，是改良作物抗逆性的新途径之一，对解决干旱导致的粮食短缺有重要意义。植物激素在逆境信号传递和启动抗逆基因表达中起关键作用。脱落酸(AbscisicAcid，ABA)是植物体内重要激素之一，调节种子休眠、萌发、幼苗生长、气孔运动等生长发育过程。同时，ABA在植物响应干旱、低温、高盐等非生物逆境胁迫中发挥重要作用。干旱引起植物体内ABA含量增加，从而影响旱胁迫响应基因的表达和气孔关闭，使植物能够抵抗干旱胁迫。因此，参与ABA代谢以及信号传递过程的基因在植物抗旱中具有重要作用。利用转基因技术或CRISPR/Cas9基因编辑等突变手段获得的这类基因的过表达植株或突变体通常具有显著的抗旱表型，为培育抗旱品种提供了候选材料。A类PP2C蛋白磷酸酶是ABA核心信号通路组分中关键的负调节因子。而在现有技术的研究中，除了ABA受体PYR/PYLs/RCARs以外，目前还未发现可以直接调节PP2C蛋白磷酸酶活性的基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白及其编码基因与应用。第一方面，本专利技术提供一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的基础上，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗旱性相关的由(a)衍生的蛋白质。进一步地，所述EAR1蛋白来自拟南芥。本专利技术进一步提供了编码所述EAR1蛋白的EAR1基因，所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如SEQIDNo.2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物抗旱性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物抗旱性相关蛋白的DNA分子。第二方面，本专利技术提供了所述EAR1蛋白在提高植物抗旱性中的应用。所述应用具体体现为：通过影响植物中EAR1蛋白的完整表达，或通过下调EAR1蛋白的表达量，提高植物的抗旱性。其中，影响EAR1蛋白完整表达的手段可采用成熟的基因编辑或其他突变手段，例如CRISPR/Cas9、T-DNA插入、EMS诱变等。下调EAR1蛋白表达量的手段可采用RNAi技术等。可选地，所述影响植物中EAR1蛋白的完整表达具体为：对EAR1蛋白的编码基因进行基因水平的人为干预，导致无法表达EAR1蛋白，导致EAR1蛋白缺失部分片段或导致EAR1蛋白氨基酸突变。在本专利技术的一个具体实施方式中，采用CRISPR/Cas9基因编辑手段进行，在本专利技术的另一个具体实施方式中，采用EMS诱变技术，在163位核苷酸上发生了C到T的突变，导致翻译提前终止，得到了翻译提前终止的ear1突变体。这些突变体表现出明显的抗旱性。进一步地，本专利技术发现了所述EAR1蛋白对植物抗旱性的影响，是通过其可与PP2C直接互作进而影响PP2C的活性，调节ABA信号途径，来影响干旱胁迫信号传递和气孔关闭，使植物能够抵抗干旱胁迫。相应的，本专利技术还提供所述EAR1基因在提高植物抗旱性中的应用，通过对所述基因进行敲除或突变，或通过改变所述基因的翻译水平，影响EAR1蛋白的表达或表达量，从而提高植物的抗旱性。对所述基因进行敲除或突变，以及改变所述基因的翻译水平，可采用本领域常规使用的方法进行，本专利技术对此不另作限定。但无论使用何种手段，只要是通过干预EAR1基因来实现提高植物抗旱性目的的技术方案，均属于本专利技术的保护范围。第三方面，本专利技术还提供了所述EAR1基因在选育抗旱新品种中的应用。例如，可以是通过对EAR1基因或EAR1蛋白的干预，得到抗旱性优良的突变体，并利用其进行后代的繁殖。借由上述技术方案，本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次在模式植物拟南芥中，发现了EAR1基因编码的功能蛋白，可通过与PP2C直接互作来增强PP2C的活性，负调节ABA信号途径。在双子叶和单子叶植物中具有序列保守性。拟南芥作为模式植物，生长周期短、基因组小且已测序完成、遗传操作简单，通过农杆菌侵染花序的方法，可以获得抗旱的过表达植株或基因编辑突变体，为品种改良提供基因资源。附图说明图1为本专利技术实施例1中CRISPR/Cas9基因编辑后的突变体测序结果，以及干旱处理后植株生长情况。图2为本专利技术实施例2中EMS诱变的突变体测序结果以及突变体旱处理表型。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例所使用的拟南芥为哥伦比亚生态型；农杆菌菌株为GV3101；作为PCR模板的pCBC-DT1T2以及作为载体的pHSE401由中国农业大学生物学院陈其军教授实验室构建(ACRISPR/Cas9toolkitformultiplexgenomeeditinginplants.BMCPlantBiol.2014,14(1):327)，并投放到addgene公司公开销售，研究者可从该公司购买这两个载体及其它种类的基因编辑载体。公司网站相关载体销售链接为https://www.addgene.org/Qi-Jun_Chen/。主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；培养基、抗生素等试剂购自sigma；引物合成和测序由英俊公司完成。实施例1CRISPR/Cas9基因编辑突变体的构建、鉴定和表型分析(1)CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建为研究植物抗旱的分子机制，本专利技术利用CRISPR/Cas9技术从拟南芥基因组中定向突变了EAR1基因。首先登陆到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶点。为提高基因编辑效率，采用双靶点编辑，序列如下：下划线区为基因读码框，斜体字体部分为靶点。atgtctcattctcatccatcaaaccacaatacacacttcttctc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白，其特征在于，是如下(a)或(b)：(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗旱性相关的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种与植物抗旱性相关的EAR1蛋白，其特征在于，是如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的基础上，经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗旱性相关的由(a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的EAR1蛋白，其特征在于，所述EAR1蛋白来自拟南芥。3.编码权利要求1所述蛋白的EAR1基因，其特征在于，所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如SEQIDNo.2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物抗旱性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物抗旱性相关蛋白的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩志忠，何俊娜，王瑜，王凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11