一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，包括离心、超声波破碎(包括接触式和非接触式超声波)、离心收集等步骤。本发明专利技术所述方法利用超声波破碎脂肪组织中大部分成熟脂肪细胞，同时应用絮状离心沉淀技术，将破碎成熟脂肪细胞产生的油滴汇聚出去，从而达到富集SVFs的目的；再利用高速离心去除细胞成分，得到ECM。经过超声波处理后，细胞活性大幅度提高、细胞凋亡率大幅度下降，从而使得移植的有效性得到很大提高；同时可得到ECM生物大分子材料，避免了操作繁琐导致的ECM含量过低和细胞因子损失。由本发明专利技术方法制备得到的生物材料可用于自体移植生物疗法，降低了脂肪移植的并发症，提高了移植脂肪的存活率。

A Method of Fat-derived Biomaterials Prepared by Ultrasound

The invention discloses a method for efficiently preparing fat source biomaterials by using ultrasound, including centrifugation, ultrasonic fragmentation (including contact and non-contact ultrasound), centrifugal collection and other steps. The method uses ultrasound to break up most mature adipocytes in adipose tissue and flocculent centrifugal precipitation technology to gather oil droplets produced by breaking mature adipocytes so as to enrich SVFs, and then uses high-speed centrifugation to remove cell components and obtain ECM. After ultrasound treatment, the cell viability and apoptotic rate were greatly increased, which greatly improved the efficiency of transplantation. At the same time, ECM biomacromolecule materials were obtained, which avoided the low ECM content and cytokine loss caused by cumbersome operation. The biological material prepared by the method of the invention can be used for autologous transplantation biotherapy, which reduces the complications of fat transplantation and improves the survival rate of the transplanted fat.

【技术实现步骤摘要】
一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法
本专利技术涉及再生医学
，具体地，涉及一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。更具体地，涉及一种利用接触式和非接触式超声波高效制备基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料的方法。
技术介绍
干细胞能够长期存活，具有不断自我繁殖能力和多向化潜能，为临床多种疾病的治疗提供了新的思路(Zuk，2010)。研究发现，干细胞主要来源有两种，即胚胎干细胞(mesenchymalstemcell，ESC)和成体干细胞(Adultstemcell，ASC)，目前国内的ESC尚无产品达到临床研究要求。在临床治疗中，常用的细胞类型是成体源性细胞，如骨髓、脐带血、脐带等来源的间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSC)等。与ESC相比，ASC广泛存在于身体的各个组织和器官，如骨髓、皮肤、脂肪和肌肉等，与此同时，同样具有高度可塑性、自我更新和定向分化的潜力(DeUgarte,etal，2003)，并且来源自身，避免了伦理道德问题，因此已经成为了目前组织工程及再生医学中最为理想的种子细胞，为一些传统药物治疗困难的疾病带来新的希望(Sterodimas,etal，2010)。脂肪组织来自中胚层，含有大量细胞基质成分。大量研究从脂肪组织中分离得到富含细胞的成分，并将其命名为基质血管成分(Chung,etal，2013)，通过系列研究证实SVF中的细胞成分具有多细胞系分化能力。研究表明，通过吸脂得到的脂肪组织经过一系列处理，分离纯化得到的细胞成分经过体外培养可以贴壁生长，在合适的条件下，这些细胞可以向成骨、成脂、成肌方向分化。从而证明基质血管成分除了含有特定成脂的前脂肪细胞外，还存在着具有多向分化能力的干细胞。脂肪组织是ASC的重要来源。脂肪组织可以从吸脂或切脂减肥的瘦身者中获取，而且过程易于被患者所接受。同时脂肪组织取材量充足，展现出广阔的临床应用前景，脂肪组织中的多功能干细胞被称之为脂肪源性干细胞(Adipose-derivedstromal/stemcell，ADSC)(Zuk,etal，2001)，简称脂肪干细胞，又称吸脂术细胞(processedlipoaspiratecell，PLA)。ADSC来源充足、具有较强的自我更新能力、分离培养较为容易、增殖较快、全能性较高，已经成为干细胞治疗领域的热点(Baglioni,etal，2009)，在组织重建与修复中展现出良好的应用前景(Bourin,etal，2013)。脂肪组织中的血管基质部分(SVF)含有大量的、具有超强生命活性的ADSC，ADSC作为脂肪组织的储备可直接分化为脂肪细胞，同时SVF还包含血管内皮细胞、基质细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞以及大量血液循环来源的细胞，是细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。以上理论已经在多项临床试验中得到验证，其在促进游离移植脂肪的存活率方面起到重大作用，另外SVF自来源丰富、取材方便的脂肪组织分离，于自身组织无免疫排斥反应，具有非常好的研究和应用价值(Zuk,etal，2001)。现有的SVF细胞的富集方法主要包括酶解法、推注破碎法等。酶解法在富集过程中加入了外源性消化酶，不仅花费较高，且需要在特定实验条件下进行，存在一定的安全性问题，所以在临床方面并无很大的利用价值。因此，研究人员已经开发了各种非酶方法来分离基质血管部分，涉及强烈的涡旋和离心(Patricia，2001)。推注法运用机械破碎原理破碎脂肪组织中成熟脂肪细胞，不加入外源性化学物质而富集SVF并且保留有SVF粘附在细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)上的生理关系。但现有的常规推注法操作繁琐，且造成移植材料SVF胶的活细胞比例低、细胞凋亡率高、细胞碎片高从而导致炎症反应比较明显，同时手术剪剪碎原始脂肪增加了污染概率。因此，现急需开发一种能有效提高基质血管片段细胞活性、降低细胞凋亡率的制备方法。此外，脂肪源的生物材料除了细胞组分如基质血管片段(SVF)外，还有非细胞组分—细胞外基质(ECM)。ECM是细胞外分子的集合，为周围细胞提供结构和生化支持。ECM也控制着周围细胞的迁移，扩散和分化(Bunnell,etal，2008)，以提高自体脂肪移植的有效性。Young等人研究了使用市售的软组织填充剂，分别采用合成的和天然的聚合物，使用和不使用细胞外基质的材料进行脂肪组织工程试验，发现ECM的产品最有可能促进新生脂肪形成，从而促进长期保留。目前分离ECM的方法，主要是Flynn提出的反复冻融+多次酶解+极性溶剂萃取的方法，该方法不仅耗时长，费用高，操作繁琐，其中细胞因子因多次反复处理丢失殆尽，且需要在特定实验条件下进行，所以在临床方面并无很大的利用价值。因此，现急需开发一种能高效富集ECM且减少细胞因子损失的方法。综上，开发一种能同时高效富集SVF和ECM的方法在脂肪源生物移植、疾病治疗及创伤修复的临床治疗方面具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术是针对推注法和反复冻融+多次酶解+极性溶剂萃取等物理方法获得SVF和ECM存在上述问题，提供了一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。本专利技术通过利用接触式和非接触式超声波高效制备基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料，不需要加入外源性化学物质，避免了操作的繁琐，通过超声波法得到的SVF活细胞比例显著增加，细胞碎片及凋亡显著降低，同时可以制备富含细胞因子的ECM。本专利技术的目的在于提供一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法。本专利技术的另一目的在于提供由上述方法制得的基质血管片段细胞材料和细胞外基质材料在制备皮肤移植材料、软组织填充材料、修复药物或皮肤抗皱产品中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，包括如下步骤：S1.将脂肪组织于1000～12000rpm条件下离心1～8min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；S2.将S1所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为600～1190W、5～55min、20～38℃；S3.将经S2非接触式超声破碎后的脂肪混合物于1000～10000rpm条件下离心3～10min；S4.经S3离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复S2～S3；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为15～325W、1～250s、15～38℃；S5.经S4接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000～12000rpm条件下离心3～8min；S6.取S5离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；S7.弃去S5离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。一方面，本专利技术采用超声波破碎细胞利用的是空化效应引起的剪切力和冲击力，是一种纯物理破碎方式，不需要加入外源性化学物质从而富集SVFs并且保留有SVFs粘附在ECM上的生理关系，且制得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将脂肪组织于1000～12000rpm条件下离心1～8min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；S2.将S1所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为600～1190W、5～55min、20～38℃；S3.将经S2非接触式超声破碎后的脂肪混合物于1000～10000rpm条件下离心3～10min；S4.经S3离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复S2～S3；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为15～325W、1～250s、15～38℃；S5.经S4接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000～12000rpm条件下离心3～8min；S6.取S5离心沉淀，加入与中间混合物等体积的生理盐水重悬细胞，即得含有高度浓缩的基质血管片段细胞材料；S7.弃去S5离心沉淀，收集上层浅黄色絮状物，即得富含细胞因子的细胞外基质材料。...

【技术特征摘要】
2018.05.28 CN 2018105242151;2018.05.28 CN 201810521.一种利用超声波高效制备脂肪源生物材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将脂肪组织于1000～12000rpm条件下离心1～8min，离心后若分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，则弃去底层肿胀液，过滤去除顶层油脂并取滤液；若不分层或分层不明显，则重复此步骤；S2.将S1所得滤液进行非接触式超声破碎，所述超声破碎条件为600～1190W、5～55min、20～38℃；S3.将经S2非接触式超声破碎后的脂肪混合物于1000～10000rpm条件下离心3～10min；S4.经S3离心后，若脂肪混合物分为三层，分别为顶层油脂、中间层混合物和底层肿胀液，且油脂层体积占脂肪混合物总体积60％以上，则弃去顶层油脂，取中间层混合物；若脂肪混合物不分层或分层不明显，则重复S2～S3；再用接触式超声波处理中间层混合物，所述超声破碎条件为15～325W、1～250s、15～38℃；S5.经S4接触式超声处理后，加等体积生理盐水混匀，于3000～12000rpm条件下离心3～8min；S6.取S5离心沉淀，加入与中间混合物等体积的...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂云飞，张玲华，
申请(专利权)人：聂云飞，
类型：发明
国别省市：广东,44