hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种筛查急性高原反应易感者的microRNA标志物，所述microRNA hsa‑miR‑3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用，可以在制备筛查急性高原反应易感者的试剂或试剂盒中应用。更提供一种通过实时荧光定量PCR方法对受测人平原血浆中hsa‑miR‑3654分子进行检测的试剂盒，并通过其表达水平的高低来预测急性高原反应发病风险。该microRNA作为分子标志物，具有特异性强，灵敏度高，无创性，便捷性等特点，适合在平原进行大规模急性高原反应易感者的筛选。

Application and kit of hsa-mir-3654 as a molecular marker for susceptibility to acute high altitude reaction

The invention relates to a microRNA marker for screening susceptible persons to acute high altitude reaction. The application of the microRNA HSA microRNA 3654 as a molecular marker for susceptible persons to acute high altitude reaction can be used in preparing reagents or kits for screening susceptible persons to acute high altitude reaction. A real-time fluorescence quantitative PCR kit was also provided to detect HSA Mi 3654 in human plain plasma, and to predict the risk of acute high altitude reaction by its expression level. As a molecular marker, the microRNA has the characteristics of high specificity, high sensitivity, non-invasiveness, convenience and so on. It is suitable for screening susceptible persons to large-scale acute high altitude reaction in plain.

【技术实现步骤摘要】
hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用和试剂盒
本专利技术属于分子生物技术及其应用领域，本专利技术涉及hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用和试剂盒，通过平原血浆hsa-miR-3654表达水平筛查急性高原反应发病风险。从而用于评定人体对急性高原反应的易感性，减少人因急性高原反应发病风险。
技术介绍
急性高原反应(acutemountainsickness,AMS)，是发生在长期生活于低海拔地区的平原人，在未适应新环境的情况下快速进入高原后1-3天产生，包括头痛、头晕、疲劳、失眠、情绪不安、胃肠胀气、腹泻及呕吐等一系列症状，其中剧烈的头疼是AMS的典型症状。地理学上把海拔高于500m，地势相对平坦或者有一定起伏的广阔地区叫高原，医学上将海拔高于2500-3000m的地方叫高原。AMS发病率较高，根据上升速度和具体海拔的不同，发病率可高达50％至85％(BartschP.andSwensonE.R.，Clinicalpractice:Acutehigh-altitudeillnesses.《TheNewEnglandJournalofMedicine》,2013,368(24)，2294-302.)；其危害性大，不仅会严重影响急进高原平原人的工作和生活能力，更严重的是，如果AMS没有得到有效的控制与治疗，很可能发展成为具有高致死率的高原脑水肿(BoosC.J.etal.,HighAltitudeandAcuteMountainSicknessandChangesinCirculatingEndothelin-1,Interleukin-6,andInterleukin-17a.《HighAltitudeMedicine&Biology》,2016,17(1),25-31.)。AMS有明显的遗传倾向性及个体易感性，高原低压低氧的环境因素和遗传因素均可以影响AMS的发生。多年以来，AMS的遗传倾向性及个体易感性一直是国内外学者关注的热点尽管有人已经提出使用低氧相关基因EGLN1、HIF-1AN、NOS3等SNP位点对AMS易感人群进行预测，但是目前看来这些标记物在准确性和特异性等方面都不尽如人意(LuksA.M.,SwensonE.R.,BartschP.，Acutehigh-altitudesickness.《Europeanrespiratoryreview:anofficialjournaloftheEuropeanRespiratorySociety》,2017,26(143))。而我国高原面积辽阔(约占国土面积的1/5)，且海拔较高(青藏高原平均海拔在4000米以上)。近年以来，随着国内外高原旅游业及高原经济建设的蓬勃发展，越来越多的平原人进入高原，而AMS的高发不仅给他们的生活和工作造成十分严重的影响，而且亦给高原地区的较脆弱卫生机构造成沉重的负担。所以亟待寻找到在平原对AMS的发病易感性进行预测的有效方法。MicroRNA是一类广泛存在于真核生物中，长度为18～24个核苷酸的非编码RNA分子。MicroRNA通过转录后水平抑制靶基因的表达，参与调控细胞分化、增殖、凋亡等生命活动，在胚胎发育、机体代谢、疾病发生发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到microRNA，提出循环microRNA的概念。并且，microRNA的表达水平的高低和其遗传基因的差异性高度相关。值得重视的是，近年来，大量的研究表明，循环microRNA对肿瘤、高血压、卒中及一系列疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性。再者血液等体液标本易于获得，临床可操作性强且创伤性小，而且循环microRNA稳定性好，检测便利，因此，循环microRNA具有作为AMS无创性生物标志物的潜能，适用于AMS易感性人群筛查(ToffoloK.,WangJ.etal.,CirculatingmicroRNAsasbiomarkersintraumaticbraininjury.《Neuropharmacology》,2018.)。而目前关于循环microRNA与AMS易感性之间的相关性，鲜见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供本专利技术涉及hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用，还提供一种筛选急性高原反应易感者试的剂盒，通过平原血浆hsa-miR-3654表达水平筛查急性高原反应发病风险。从而用于评定人体对急性高原反应的易感性，减少人因急性高原反应发病风险。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用。进一步，所述hsa-miR-3654的序列如SEQIDNO：2所示。进一步，所述hsa-miR-3654核酸分子在靶血浆中的表达与对照血浆中的表达相比被下调。进一步，所述应用为hsa-miR-3654作为microRNA分子标志物在制备筛查急性高原反应易感者的试剂或试剂盒中应用。2.根据hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用制备的筛查急性高原反应易感者试剂盒，所述试剂盒包含能够分别与hsa-miR-3654反转录产物特异性结合并进行PCR扩增的引物。进一步，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQIDNo.17所示，反向引物序列如SEQIDNo.18所示。进一步，所述hsa-miR-3654的序列如SEQIDNO：2所示。进一步，所述hsa-miR-3654核酸分子在靶血浆中的表达与对照血浆中的表达相比被下调。进一步，所述试剂盒还包括miRNART反应体系，所述miRNART反应体系按每10ul计，包括：逆转录引物1ul，5xreversetranscriptionBuffer2ul，RTaseMix2ul，RNase-freeH2O3ul，其余2ul为测试RNA。进一步，所述逆转录引物序列如SEQIDNO：9所示。进一步，所述试剂盒RT反应温度参数：42℃60min，70℃10min.进一步，所述试剂盒还包括miRNAqPCR反应体系，所述miRNAqPCR反应体系按每20ul计包括：SYBRGreenMix10ul，miRNAForwardprimer0.8ul，miRNAReverseprimer0.8ul，ddH2O6.4ul，其余为RT反应产物2ul。进一步，所述试剂盒miRNAqPCR反应条件为预变性95℃10min，变性95℃2s，退火60℃20s，延伸70℃10s。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过平原世居者平原血浆循环microRNA的芯片谱筛查，待人群进入高原后，根据AMS国际通用诊断标准路易斯湖评分诊断系统区分AMS和健康人群，结合其高原缺氧暴露后的AMS发病情况，发现平原血浆循环hsa-miR-3654在AMS易感者和健康人之间存在着显著差异。再通过SYBR(即SYBRGREEN染料，缩写SYBR)实时荧光定量PCR(聚合酶链反应)的方法检测了另一独立人群的平原血浆循环各microRNA表达水平，充分证实了平原血浆循环hsa-miR-3654表达水平和AMS的易感性之间存在着相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.hsa‑miR‑3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用。

【技术特征摘要】
1.hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述hsa-miR-3654的序列如SEQIDNO：2所示。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述hsa-miR-3654核酸分子在靶血浆中的表达与对照血浆中的表达相比被下调。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为hsa-miR-3654作为microRNA分子标志物在制备筛查急性高原反应易感者的试剂或试剂盒中应用。5.根据权利要求1-4任一项所述应用制备的筛查急性高原反应易感者试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够分别与hsa-miR-3654反转录产物特异性结合并进行PCR扩增的引物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQIDNo.17所示，反向引物序列如SEQIDNo.18所示。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，柯贤峰，高钰琪，董华平，何姝，鄂国基，孙滨达，张二龙，陈建，张刚，徐刚，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50