细菌基因组DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌基因组DNA提取方法，DNA的提取方法包括以下步骤：1)取细菌悬浮液离心除去上清液，用无菌的NE缓冲液洗涤沉淀，接着重悬于无菌TE缓冲液，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲提取液，混合并放置；3)在所述混合液中加入乙提取液，混合并孵育；4)在所述混合液中加入乙酸铵混合调整；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至Phase Lock Gel Heavy管中混合，并离心，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷的无水乙醇混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA。本发明专利技术的提取方法可有效用于细菌基因组DNA提取，提取效率高，操作简单、方便。

Extraction of bacterial genomic DNA

The invention discloses a method for extracting bacterial genomic DNA, which comprises the following steps: 1) centrifuging bacterial suspension to remove supernatant, washing and precipitating with sterile NE buffer, then suspending in sterile TE buffer to obtain a mixture; 2) adding A extract into the mixture, mixing and placing it; 3) adding B extract into the mixture, mixing and incubating it; (4) adding ammonium acetate to the mixing solution for mixing adjustment; 5) adding phenol/chloroform solution to the mixing solution and mixing it into the phase mixing; 6) transferring the mixing solution to the Phase Lock Gel Heavy tube for mixing, centrifuging and retaining the top water phase; 7) adding cold anhydrous ethanol to the water phase for mixing, resulting in white flocculent precipitation as bacterial genomic DNA. The extraction method of the invention can be effectively used for bacterial genomic DNA extraction, with high extraction efficiency, simple operation and convenience.

【技术实现步骤摘要】
细菌基因组DNA提取方法
本专利技术涉及一种细菌基因组DNA提取方法。
技术介绍
第三代基因测序系统Pacbio测序具有读长长、单分子，无GC偏好性、测序的同时可以检测碱基修饰的独特优势，应用广泛。以往基于传统方法对于测序的细菌基因组DNA的提取方法，需要在4℃以下，以高于10000g/分钟的高速离心下分离提取DNA过程中的有机相和含有DNA的无机相，在这样的严苛的实验条件下，不仅使得实验操作的复杂，而且容易导致实验结果不稳定。此外，传统的细菌基因组DNA的提取方法，提取出的DNA纯度不高，易受到提取液等杂质的污染，而试剂盒法提取DNA的成本又高。因此需要一种简便、高效地细菌基因组DNA的提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种新的细菌基因组DNA提取方法，基于该提取方法的提取效率高，操作简便。本专利技术的另一个目的是提供上述提取的细菌基因组DNA的用途。为达上述目的，本专利技术提供：一种细菌基因组DNA的提取方法，至少包括以下步骤：1)取细菌悬浮液20～40ml，于0～4℃下，以及2000～6000g/分的速度下，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于-10～0℃下，放置45～60分钟；3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至锁相凝胶(PhaseLockGelHeavy)管中，进行混合，以1000-3000g/分钟的速度，离心5～10分钟，取出顶部水相至新的离心管中；7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；其中，NE缓冲液为0.15mol/l氯化钠(NaCl)、50mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)；TE缓冲液为50mmol/l三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0、50mmol/lEDTA；甲液为0.5～1ml25mmol/lTrispH8.0、10～20ul10mg/ml溶菌酶(ReadyLyse)、30～70ul10mg/ml核糖核酸酶(RNase)；乙液为0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、50mmol/lTrispH7.5、40mmol/lEDTA、2mg/ml蛋白酶K。可选地，在所述6)中，保留的所述顶部水相为加入8～15ml苯酚/氯仿溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟；加入8～15ml氯仿/异戊醇溶液并混合，以1000～2000g/分钟的速度，离心5～10分钟后的顶部水相。可选地，所述苯酚/氯仿溶液为苯酚与氯仿体积比为25/24。可选地，所述氯仿/异戊醇溶液为氯仿与异戊醇的体积比为24/1。可选地，在7)中，将所述细菌组DNA在4℃下溶解在所述TE缓冲液中，保存。更进一步地，向溶解有细菌组DNA的所述TE缓冲液中，加入NaCl，调整NaCl的浓度为1～2mol/l，接着再次加入所述冷的冷100％的无水乙醇，获得白色絮状沉淀。可选地，所述混合为倒置混合，但不产生涡旋。使用本专利技术的提取方法提取的细菌组DNA用于在第三代基因测序Pacbio测序系统。在本专利技术中，利用了DNA比多糖以及蛋白更易溶于水的特性，与现有技术相比，本专利技术的提取过程操作简便，在整个DNA的提取过程中不需要在大于10000g/分钟的高速低温离心，即可以常温下可以分离含DNA相与有机相，且不需要多次转移处理，降低污染几率和产率。根据本专利技术的提取方法提取的DNA更纯净，结果更加稳定，提取过程中杂质更容易从样本中分离出去，应用微量紫外-可见光分光光度计测试DNA的纯度和浓度，证明本专利技术中采取的提取方法得到的DNA在260nm处有单一明显峰值，260nm/230nm吸光度的比值更高。此外，本专利技术的提取方法使用的试剂简单易得，成本较低，避免了试剂盒法操作的高成本，以及还需要蛋白质过柱的缺陷。附图说明图1基因组DNA样本的紫外可见吸收谱图；图2基因组DNA样本的凝胶电泳图。具体实施方式以下将结合附图和具体的实施方式，对本专利技术进行更详细的描述，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。本专利技术的提取方法包括，1)取细菌悬浮液20～40ml，于0～4℃下，以及2000～6000g/分钟的速度下，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液。在1)中，细菌悬浮液为细菌在250ml烧瓶中以250g/分钟的速度下在GYE培养基(20g/l葡萄糖、15g/l酵母膏、35g/l乙醇)中培养过夜，生长至静止期，不过度生长下获得的。在1)中，NE缓冲液由0.15mol/lNaCl、50mmol/lEDTA组成，经NE缓冲液至少洗涤沉淀两次后，可以去除表面大量多糖，降低在后续的提取操作过程中的污染问题，提高提取效率。在1)中，TE缓冲液由50mmol/lTrispH8.0、50mmol/lEDTA组成，使用无菌TE缓冲溶液2.0～3.0ml，例如2.0ml、2.5ml，在该范围内的TE缓冲溶液，可以充分将细菌悬浮，以便进行分离。将1)中得到的混合液在-20℃冷冻，在进行如下所述的2)时，于室温下解冻。本专利技术的提取方法还包括，2)在混合液中加入甲液，进行混合，于-10～0℃下，放置45～60分钟。在2)中，甲液为0.5～1ml25mmol/lTrispH8.0、10～20ul10mg/ml溶菌酶、30～70ul10mg/ml核糖核酸酶，例如，05ml25mmol/lTrispH8.0、10ul10mg/ml溶菌酶、50ul10mg/ml核糖核酸酶，在该范围内的甲液，可以充分溶解蛋白质，释放DNA。本专利技术的提取方法还包括，3)在混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃孵育40～70分钟。在3)中，乙液为0.5％SDS、50mmol/lTrispH7.5、40mmol/lEDTA、2mg/ml蛋白酶K。在3)中，加入乙液的混合液于35～40℃孵育40～70分钟，期间每10-15分钟倒置混合一次。本专利技术的提取方法还包括，4)在混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合，调整混合液的pH值。本专利技术的提取方法还包括，5)在混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀。在5)中，苯酚/氯仿溶液为8～15ml，例如8ml、10ml、15ml，苯酚与氯仿的体积比为25与24。本专利技术的提取方法还包括，6)将混合液转移至PhaseLockGelHeavy管中，例如50mlPhaseLockGelHeavy管，混合后，离心5～10分钟，保留顶部水相。在6)中，PhaseLockGelHeavy管为一种分相凝胶，可以将溶有DNA的水相与溶有有机质的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，至少包括以下步骤：1)取细菌悬浮液20～40ml，于室温以2000～6000g/分速度，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于冰上，放置45～60分钟；3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至锁相凝胶管中，进行混合，以1000‑3000g/分钟的速度，离心5～10分钟，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；其中，NE缓冲液为0.15mol/l NaCl、50mmol/l EDTA；TE缓冲液为50mmol/l Tris pH 8.0、50mmol/l EDTA；甲液为0.5～1ml 25mmol/l Tris pH 8.0、10～20ul 10mg/ml溶菌酶、30～70ul 10mg/ml核糖核酸酶；乙液为0.5％SDS、50mmol/l Tris pH 7.5、40mmol/l EDTA、2mg/ml蛋白酶K。...

【技术特征摘要】
1.一种细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，至少包括以下步骤：1)取细菌悬浮液20～40ml，于室温以2000～6000g/分速度，离心10～15分钟，除去上清液，用无菌NE缓冲液15～25ml至少洗涤沉淀两次，接着重悬于无菌TE缓冲液2.0～3.0ml，得一混合液；2)在所述混合液中加入甲液，进行混合，于冰上，放置45～60分钟；3)在所述混合液中加入乙液1.0～5.0ml，进行混合，于35～40℃下，孵育40～70分钟；4)在所述混合液中加入7.5mol/l乙酸铵1.0～2.0ml混合；5)在所述混合液中加入苯酚/氯仿溶液8～15ml，并混合至相混匀；6)将所述混合液转移至锁相凝胶管中，进行混合，以1000-3000g/分钟的速度，离心5～10分钟，保留顶部水相；7)在所述水相中加入冷100％的无水乙醇，并进行混合，所得白色絮状沉淀为细菌基因组DNA；其中，NE缓冲液为0.15mol/lNaCl、50mmol/lEDTA；TE缓冲液为50mmol/lTrispH8.0、50mmol/lEDTA；甲液为0.5～1ml25mmol/lTrispH8.0、10～20ul10mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋洪新，许旭，
申请(专利权)人：安徽华明太合生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34