具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用。该组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。特别是在诱导培养的过程中配合适当的低氧处理，能进一步增强脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的量。

Compounds and Their Applications with the Function of Promoting Mesenchymal Stem Cells to Secret Cytokines

The present invention relates to a combination and its application which can promote the secretion of cytokines by mesenchymal stem cells. The composition comprises 0.15-1g vitamin, 0.53-5g insulin, 0.1-1g trisodium citrate and 0.25-1g hyaluronic acid. The composition is added to the induction medium formed in high sugar DMEM, and the induction medium can stimulate adipose mesenchymal stem cells to secrete cytokines. Especially in the process of induction and culture, combined with appropriate hypoxia treatment, can further enhance the secretion of cytokines by adipose mesenchymal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物及应用。
技术介绍
干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝脏生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。传统技术通过向干细胞培养基中添加诱导成分，刺激干细胞分泌细胞因子，但还未有公开有诱导组合物，能够用于刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。
技术实现思路
基于此，本专利技术的主要目的是提供一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，所述的组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。在其中一些实施例中，所述的组合物包括：0.15～0.65g维生素、0.53～3g胰岛素、0.5～1g枸橼酸三钠、0.25～0.55g透明质酸。在其中一些实施例中，所述的组合物包括：0.55～0.65g维生素、2.5～3g胰岛素、0.5～0.8g枸橼酸三钠、0.5～0.55g透明质酸。本专利技术的另一目的是提供上述的组合物在诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子中的应用。本专利技术的再一目的是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15～1g的维生素、0.53～5g的胰岛素、0.1～1g的枸橼酸三钠、0.25～1g的透明质酸制备而成。在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15～0.65g的维生素、0.53～3g的胰岛素、0.5～1g的枸橼酸三钠、0.25～0.55g的透明质酸制备而成。在其中一些实施例中，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.55～0.65g的维生素、2.5～3g的胰岛素、0.5～0.8g的枸橼酸三钠、0.5～0.55g的透明质酸制备而成。本专利技术的还一目的是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的方法，所述方法包括：(1)获取脂肪间充质干细胞，于传代培养基中进行传代培养；(2)弃去所述传代培养基，清洗所得脂肪间充质干细胞，更换至上述的培养基中进行诱导培养。在其中一些实施例中，所述方法包括对所述诱导培养的脂肪间充质干细胞进行低氧处理；所述的低氧处理是指控制所述脂肪间充质干细胞的培养环境中含氧量不高于10％。在其中一些实施例中，所述低氧处理是在所述诱导培养开始1h～3h开始进行；所述的含氧量为3％～8％；所述低氧处理的时间不超过84h。在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述传代培养基为无血清脂肪培养基，传代培养至细胞生长密度达到50％～65％；步骤(2)中，所述清洗采用磷酸盐缓冲液。与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：本专利技术将维生素、胰岛素、枸橼酸三钠、透明质酸以合适用量配合，形成具有进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物。将该组合物添加至高糖DMEM中形成的诱导培养基，用该诱导培养基能够刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。特别是在诱导培养的过程中配合适当的低氧处理，能进一步增强脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的量。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术实施例采用的脂肪间充质干细胞可以但不局限于通过如下步骤分离：(1)将无菌抽取的脂肪组织，浸泡于含P/S双抗的无菌盐水中，送入实验室；(2)取出脂肪组织，无菌生理盐水，洗涤3遍，将脂肪组织转移至细胞培养皿，加入适量含有0.25％(w/v)EDTA、0.5％(w/v)蛋白酶复合酶的水溶液，放入37℃细胞培养箱消化3h；(3)用含血清的培养基终止消化，用滤网过滤除去大块脂肪组织，所得滤液转至离心管内，1000rpm离心10min后除去上清液，沉淀细胞用PBS缓冲液洗涤3遍，以去除残留血清，LONZA无血清脂肪培养基重悬细胞后接种至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的培养瓶，放置于细胞培养箱内，37℃下5％CO2进行培养，获得脂肪间充质干细胞。选用自体脂肪组织提取脂肪间充质干细胞，来源广泛，避免免疫原性。实施例1本实施例提供一种促进间充质干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用。具体地，是将该组合物添加到高糖DMEM中制备脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基，用于刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞因子。一、脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基(见表1)：500mL高糖DMEM、0.65gVC、3g胰岛素、0.5g枸橼酸三钠、0.55g透明质酸。二、脂肪间充质干细胞因子的制备：(1)待脂肪间充质干细胞细胞长至85％左右，于LONZA无血清脂肪培养基中进行传代培养；(2)将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，2h后，对细胞进行37℃，5％CO2，5％O2低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养72h；(3)收集各个时间段的细胞上清液，10000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片；(4)收集的上清液，经0.22μm滤膜过滤，然后通过40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100D超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液，即可；(5)浓缩液可冷冻干燥，保存。实施例2本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括：1、脂肪间充质干细胞分泌细胞因子诱导培养基配方，本实施例中的培养基配方(见表1)具体如下：500mL高糖DMEM、0.15gVC、0.53g胰岛素、0.1g枸橼酸三钠、0.25g透明质酸。2、步骤(2)中，将P3～P5细胞传至盛放有LONZA无血清脂肪培养基的细胞培养皿中，培养至细胞生长密度达到50％～65％时，弃去原有培养基，用PBS洗三遍，换成脂肪干细胞分泌细胞因子诱导培养基进行培养，1h后，对细胞进行37℃，5％CO2，10％O2低氧处理，每隔12观察细胞的生长状况，连续培养84h；其他操作同实施例1。实施例3本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括：1、脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。

【技术特征摘要】
1.一种具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：0.15～1g维生素、0.53～5g胰岛素、0.1～1g枸橼酸三钠、0.25～1g透明质酸。2.根据权利要求1所述的具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：0.15～0.65g维生素、0.53～3g胰岛素、0.5～1g枸橼酸三钠、0.25～0.55g透明质酸。3.根据权利要求2所述的具有促进间充质干细胞分泌细胞因子功效的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：0.55～0.65g维生素、2.5～3g胰岛素、0.5～0.8g枸橼酸三钠、0.5～0.55g透明质酸。4.权利要求1至3任一项所述的组合物在诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子中的应用。5.一种诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，其特征在于，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终浓度为0.15～1g的维生素、0.53～5g的胰岛素、0.1～1g的枸橼酸三钠、0.25～1g的透明质酸制备而成。6.根据权利要求5所述的诱导脂肪间充质干细胞分泌细胞因子的培养基，其特征在于，所述培养基是通过向每500mL的高糖DMEM中添加终...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，刘少辉，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44