骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用，属于生物医学工程技术领域，母体自身的骨髓间充质干细胞的线粒体的功能良好，注射到卵母细胞后可以改善卵母细胞的质量；骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；向容器中加入预冷的Mito‑Cyto Buffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；对上述步骤收集的上清液继续离心，收集上清液；重复上述步骤。

Application of Mitochondria of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Improving Oocyte Drugs

The invention discloses the application of mitochondria of bone marrow mesenchymal stem cells in improving oocyte drugs, belonging to the field of Biomedical Engineering technology. The function of mitochondria of bone marrow mesenchymal stem cells of the mother is good, and the quality of the oocyte can be improved after injection into the oocyte. The mitochondria of bone marrow mesenchymal stem cells are extracted through the following steps: resuscitation of bone marrow; Mesenchymal stem cells were digested; after digestion, bone marrow mesenchymal stem cells were collected into containers; supernatants were discarded by centrifugation and then PBS buffer was added to the containers for resuspension; bone marrow mesenchymal stem cells were suspended by centrifugation after suspension; precooled Mito Cyto Buffer was added to the containers for resuspension and then transferred to another container; bone marrow mesenchymal stem cells were mixed. The liquid was sucked several times; the homogenate of bone marrow mesenchymal stem cells was transferred to another container for centrifugation and supernatant collection; the supernatant collected by the above steps was centrifuged to collect supernatant; the above steps were repeated.

【技术实现步骤摘要】
骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用
本专利技术属于生物医学工程
，尤其涉及骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用。
技术介绍
卵子质量差是导致辅助生殖反复失败的重要原因。线粒体数目的减少与卵母细胞衰老有关，功能障碍的线粒体会影响卵母细胞成熟的晚期阶段和早期胚胎形成。因此，关于改善卵子质量的研究主要集中在改善线粒体的功能上。研究或临床应用阶段用于改善卵子质量的方法有：1)线粒体活化剂：生长激素、辅酶Q10、白藜芦醇、左旋肉碱、α-硫辛酸，其中，临床常用生长激素、辅酶Q10改用于善卵子质量，其余活化剂应用较少；2)线粒体替代治疗：细胞浆移植、核移植、纺锤体移植和极体移植；线粒体替代治疗还处于实验研究阶段，未进入临床应用中。目前，暂无有效改善卵子质量的药物或方法；原因在于上述两种方法均存在许多不足：1)线粒体活化剂疗效不确切、不显著，效果有限；2)在线粒体替代治疗中，异体细胞移植因会形成三亲胚胎的伦理问题；3)在线粒体替代治疗中，不同个体来源的线粒体DNA与核基因组合后，暂无系统评估后代的健康风险，不可预测；4)线粒体替代治疗的效果不稳定。因此，有必要研发一种用于改善卵母细胞质量的药物。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用，母体自身的骨髓间充质干细胞的线粒体的功能良好，注射到卵母细胞后可以改善卵母细胞的质量：用于体外受精、育儿。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：骨髓间充质干细胞的线粒体在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。作为上述技术方案的改进，所述骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：S1)复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；S2)离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；S3)向容器中加入预冷的Mito-CytoBuffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中，并放入冰块；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；S4)将骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；S5)对步骤S4收集的上清液继续离心，收集上清液；S6)重复步骤S5。另外，本专利技术还提供一种用于改善卵母细胞质量的药物，其包含骨髓间充质干细胞的线粒体。作为上述技术方案的改进，所述骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：S1)复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；S2)离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；S3)向容器中加入预冷的Mito-CytoBuffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中，并放入冰块；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；S4)将骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；S5)对步骤S4收集的上清液继续离心，收集上清液；S6)重复步骤S5。作为上述技术方案的改进，所述药物中骨髓间充质干细胞的线粒体DNA拷贝数为4000～5000个。本专利技术有益效果：本专利技术提供骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用，母体自身的骨髓间充质干细胞的线粒体的功能良好，注射到卵母细胞后可以改善卵母细胞的质量；本专利技术具有以下优点：1)选择了一种高质量来源(骨髓间充质干细胞)的线粒体，治疗效果显著，成功使一名因胚胎质量差反复移植失败的女性妊娠、并分娩一健康婴儿；2)不存在异体细胞线粒体移植的问题，从而不会导致“三亲”子代的伦理隐患，也不会因不同来源的线粒体-核基因组合使后代的健康存在潜在风险；3)提供了一种标准化的技术流程，使技术更稳定，疗效更稳定。附图说明图1为显示骨髓间充质干细胞的分离培养及线粒体的提取；图2为分离的骨髓间充质干细胞的鉴定；图3为线粒体的电镜图；其中，3A来源于患者卵母细胞，3B来源于患者骨髓间充质干细胞；图4显示线粒体的膜电位；图5显示卵母细胞接受线粒体注射；其中，5A为线粒体注射过程，5B显示线粒体注射入卵母细胞内，5B图中白色亮点为线粒体和荧光标记的精子；图6显示骨髓间充质干细胞线粒体注射卵母细胞后，囊胚发育良好。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明。骨髓间充质干细胞的分离、接种1)在20ml骨髓血样中加入10mlPBS混匀，用50ml离心管分装2管ficoll(密度1.077)淋巴细胞分离液15ml，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上，水平离心机700g离心25min；2)从界面上取出的MNC(云雾状层细胞)并加入50ml离心管内；3)加入PBS15ml重悬，500g离心10min后弃上清；重复一次该步骤，并细胞计数；4)将细胞种入六孔板中，每孔加2ml培养液，细胞密度不少于2×105/孔；5)在CO2体积分数5％、湿度95％以上和温度37℃条件下培养箱中静置培养，3～5天更换一次培养液；6)待每孔细胞汇合度为80％～90％时，弃去培养液，用适量PBS液洗涤2次；7)用0.25％EDTA(2.5g/L，0.25％)胰蛋白酶，消化3min后终止胰酶作用；8)用吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，加PBS至液体体积为8ml，300g离心5min，弃去上清，细胞用于后期实验。骨髓间充质干细胞的鉴定用脂肪细胞诱导培养基和成骨细胞诱导培养基对细胞进行诱导分化(成脂分化和成骨分化)，随后进行油红染色和茜素红染色，并在显微镜下观察是否成功分化成脂肪细胞和成骨细胞，利用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表型为CD29/73/90/44/105/166阳性且CD45/34阴性的细胞。如图2所示，本专利技术分离的细胞为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞的消化1)全部吸出培养液弃去后，加入适量的PBS液；2)弃去培养皿/瓶内PBS，加入适量的PBS液；3)加入安全柜内复温的0.25％EDTA(2.5g/L，0.25％)胰蛋白酶，消化3min，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时(细胞开始变圆)加入完全培养液，轻轻摇匀终止胰酶作用。线粒体定量操作线粒体基因提取(试剂盒：天根TIANampGenomicDNAKitcat:#SP304-2)1)消化后的细胞，细胞数要求106个，400g离心5min沉淀弃上清；加入200μlGA、20μlProteinaseK溶液、200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min；2)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；3)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；4)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；6)重复操作步骤5；7)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.骨髓间充质干细胞的线粒体在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.骨髓间充质干细胞的线粒体在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：S1)复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；S2)离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；S3)向容器中加入预冷的Mito-CytoBuffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中，并放入冰块；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；S4)将骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；S5)对步骤S4收集的上清液继续离心，收集上清液；S6)重复步骤S5。3.一种用于改善卵母细胞质量的药物，其特征在于，包含骨髓间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓燕，方丛，
申请(专利权)人：梁晓燕，方丛，
类型：发明
国别省市：广东,44