一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料制造技术

本发明专利技术公开了一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料，属于骨组织工程技术领域。本发明专利技术通过将重组TG2腺病毒转染到具有多向分化能力的EMSCs中，在体外评估了TG2‑EMSCs对纤维蛋白支架成骨的影响，并将含TG2‑EMSCs的生物活性支架植入颅骨缺损的SD大鼠中，检测其修复骨缺损的能力。结果表明，用含TG2‑EMSCs的纤维蛋白支架移植治疗颅骨缺损，受损区域在两周内显示55％的愈合，而含天然EMSCs的纤维蛋白支架在相同时间点显示17％的愈合。且这种生物支架生物相容性高、稳定、成本低且操作简便。因此，含TG2‑EMSCs的纤维蛋白支架对于修复骨缺损具有重要的临床应用价值。

A Composite Bioscaffold Material for Repairing Bone Defects

The invention discloses a composite biological scaffold material for repairing bone defects, which belongs to the field of bone tissue engineering technology. By transfecting recombinant TG2 adenovirus into EMSCs with multidirectional differentiation ability, the effect of TG2 EMSCs on the osteogenesis of fibrin scaffolds was evaluated in vitro, and the bioactive scaffolds containing TG2 EMSCs were implanted into SD rats with skull defects to test their ability to repair bone defects. The results showed that fibrin scaffolds containing TG2 EMSCs were used to treat skull defects. 55% of the injured areas healed within two weeks, while 17% of the fibrin scaffolds containing natural EMSCs healed at the same time point. The scaffold has high biocompatibility, stability, low cost and simple operation. Therefore, fibrin scaffolds containing TG2 EMSCs have important clinical value in repairing bone defects.

【技术实现步骤摘要】
一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料
本专利技术涉及一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料，属于骨组织工程

技术介绍
整形外科中大骨缺损的修复是整形外科医生常面临的重大问题。骨缺损的常见原因包括急性骨损伤、良性肿瘤、恶性肿瘤、骨感染和骨不连。骨缺损的常用治疗方法是自体骨移植，即在患者机体上采集新鲜骨组织进行自体移植。然而，这种治疗通常需要两次手术，这不仅增加了感染的可能性，而且还可能导致骨畸形、疼痛甚至功能性问题。自体骨移植的缺点使其不能成为最佳的骨缺损修复方法。目前，使用有效的基因工程和组织工程技术联合自体干细胞移植是一种新兴的骨损伤治疗方法。成骨细胞负责产生骨基质并促进类骨质矿化，在骨修复和重建过程中发挥重要作用。鉴于成骨细胞在骨修复中的关键作用，植入可直接分化为成骨细胞的干细胞将是一种有临床应用前景的骨缺损治疗方法。已有报道显示骨髓含有具有成骨潜能的间充质干细胞(BMSC)，然而，骨髓中能获取的BMSCs不足以修复骨缺损。此外，BMSCs采集过程对供体来说是痛苦的且易导致骨髓感染。因此，骨科研究人员仍在努力寻找理想的自体干细胞来修复骨缺损。已有研究报道，下鼻甲的呼吸道粘膜含有神经嵴迁移分化的鼻粘膜骨髓间充质干细胞(EMSCs)，该细胞具有多向分化潜能，可以分化为外胚层和中胚层谱系细胞(TG2基因修饰的鼻粘膜间充质干细胞向神经样细胞分化的研究[J].神经解剖学杂志,2018(3))。而且，鼻粘膜EMSCs可以从成人下鼻甲的呼吸道粘膜中轻易收获，损伤很小，对嗅觉无损伤。研究表明，当EMSCs接种在纤维蛋白凝胶上时，可以诱导EMSCs在更大程度上分化成成骨细胞。因此，EMSCs可以用作新型种子细胞，纤维蛋白凝胶可以作为其生长和分化的支架(张雪松,李正南,荆丹峰,etal.外胚层间充质源神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植修复大鼠脊髓损伤[J].解剖学杂志,2016,39(2):207-210)。装载EMSCs的支架可以移植修复骨损伤。然而，体内天然纤维蛋白凝胶的快速降解对于使用纤维蛋白凝胶作为修复大骨缺损的支架是不利的。因此，构建具有长期稳定性和生物活性的并可装载细胞的纤维蛋白支架，对于干细胞/组织工程支架移植修复严重骨缺损具有重要的应用价值。转谷氨酰胺酶2(TG2)是转谷氨酰胺酶家族的成员，其发挥蛋白质之间的转酰胺和交联功能。大多数细胞的TG2存在于细胞质中，一些也存在于线粒体和细胞核中，而一些TG2(1-20％)位于细胞外，包括质膜和细胞外基质(ECM)。TG2还具有重要的酶和非酶功能。TG2可以交联各种细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和骨桥蛋白以及一些可溶性生长因子，例如BMP-2和PDGF。此外，TG2通过与整联蛋白和生长因子受体的非共价相互作用来调节ECM和可溶性生长因子之间的相互作用。已有研究表明TG2表达与软骨细胞分化也有关，并且TG2敲除小鼠的软骨细胞培养物形成低水平的基质钙化。相反，随着外源性TG2的加入，软骨细胞肥大和矿化增加。Kaartinen等人在体外鉴定了膜内骨和成骨细胞样骨细胞中高活性的TG2酶。此外，许多报道已经证明TG2参与骨细胞粘附和ECM钙化。Johnson等人报道TG2在TG2基因修饰的软骨细胞和半月板细胞培养物中促进了体外矿化。然而，没有研究报道过TG2在EMSCs分化为成骨细胞和TG2基因修饰的EMSCs移植修复骨损伤中的作用。目前，骨组织工程支架材料包括有机聚合物材料、陶瓷材料、金属材料等。有机聚合物骨组织支架材料中，用左旋聚乳酸、聚羟基乙酸等可降解吸收性高分子材料加工而成的纤维状支架材料和海绵状支架材料在软骨组织工程中已获得广泛应用。但这类支架材料弹性模量低、成本高、受力时易变形、容易导致种子细胞损伤且降解吸收时间过长。由于这些支架材料表面不含有细胞黏附分子的识别分子，如RGD序列，所以与细胞的生物相容性比较差。例如，聚乳酸作为骨组织工程支架材料，具有降解速率过快、亲水性差、降解产物呈酸性、缓慢降解后易出现并发症等缺点。生物陶瓷材料虽然有生物可降解性、可促进干细胞向成骨细胞分化，但种子细胞在支架内难以迁移和增殖，此外，陶瓷本身的脆性亦限制了其在临床中的应用。其他骨组织工程支架材料或多或少都存在着细胞相容性差、诱导成骨细胞分化的能力差、体内降解不可控、降解产物有副作用以及制作成本高等缺点。因此，提供一种生物相容性高、体内降解时间适合、诱导成骨细胞分化能力强，促进骨组织再生的效果肯定、制作成本低且操作简便的装载干细胞的骨组织工程复合支架，对于临床上严重骨缺损的治疗具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于修复骨缺损的复合生物支架，以表达谷氨酰胺转氨酶2(TG2)的EMSCs(鼻粘膜骨髓间充质干细胞)为种子细胞，以纤维蛋白凝胶为支架载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述骨缺损包括颅骨缺损、躯干骨缺损或四肢骨缺损。在本专利技术的一种实施方式中，种子细胞初始密度为105-108个/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述EMSCs是以pShuttle-IRES-hrGFP2为载体，表达TG2。在本专利技术的一种实施方式中，所述TG2的氨基酸序列如NCBI：NP_803473.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，纤维蛋白凝胶由溶液A和溶液B混合后凝固制成，溶液A为溶解在PBS中50-100mg/mL大鼠纤维蛋白原溶液，溶液B中每毫升PBS含有10-20U大鼠凝血酶。在本专利技术的一种实施方式中，溶液A和溶液B的体积比为(1:2)-(2:1)。进一步地，溶液A和溶液B的体积比为1:1。本专利技术的第二个目的是提供一种上述的复合生物支架的制备方法，其特征在于，将权利要求4中所述的溶液A和溶液B按(1:2)-(2:1)的体积比混合，得到的纤维蛋白原-凝血酶混合物加到高通量细胞培养板上，孵育表达TG2的EMSCs细胞；用胰蛋白酶消化上述孵育后的细胞，离心沉淀，收集细胞作为种子细胞；将种子细胞接种到上述培养板内的纤维蛋白支架上在本专利技术的一种实施方式中，孵育细胞的条件为：35-38℃，30-40min。本专利技术的第三个目的是提供上述的复合生物支架在制备医疗器械领域内的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过将谷氨酰胺转氨酶2(TG2)基因重组的腺病毒转染到具有多向分化能力的EMSCs(鼻粘膜骨髓间充质干细胞)中，得到TG2-EMSCs细胞，该细胞可以分泌高水平的TG2。将TG2-EMSCs种植于纤维蛋白支架，支架内细胞分泌的TG2使细胞产生的生长因子与ECM蛋白分子(骨基质)以及支架材料纤维蛋白分子交联，使该复合支架具备生物学活性和三维结构的稳定性。本专利技术制作了一种TG2-EMSCs/纤维蛋白组织工程支架，并在体外观察了TG2-EMSCs在纤维蛋白支架上的成骨作用。在此基础上，将TG2-EMSCs/纤维蛋白组织工程支架植入颅骨缺损的SD大鼠中，评估其修复骨缺损的能力。结果表明，TG2-EMSCs可以过表达TG2，并可在纤维蛋白支架上向成骨细胞分化；TG2还可以促进骨基质沉积到支架中；用含TG2-EMSCs的纤维蛋白支架移植治疗颅骨缺损，在两周内可使骨缺损愈合55％，而用含未转基因的EMSCs/纤维蛋白支架移植治疗的颅骨缺损在相同时间点显示为骨缺损愈合17％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于修复骨缺损的复合生物支架，其特征在于，以表达TG2的EMSCs为种子细胞，以纤维蛋白凝胶为支架载体。

【技术特征摘要】
1.一种用于修复骨缺损的复合生物支架，其特征在于，以表达TG2的EMSCs为种子细胞，以纤维蛋白凝胶为支架载体。2.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，所述骨缺损包括颅骨缺损、躯干骨缺损或四肢骨缺损。3.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，种子细胞初始密度为105-108个/mL。4.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，所述EMSCs是以pShuttle-IRES-hrGFP2为载体，表达TG2。5.如权利要求1或4所述的复合生物支架，其特征在于，所述TG2的氨基酸序列如NCBI：NP_803473.1所示。6.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，纤维蛋白凝胶由溶液A和溶液B混合后凝固制成，溶液A为溶解在PBS中50-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆乃彦，张轩，翁雨燕，杨国锋，余雪健，王霁月，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32