分析核酸片段的方法技术

本文提供了用于富集生物样品中的靶核酸并分析所述核酸的方法。在一些情况下，富集生物样品中与癌症或肿瘤相关的靶核酸。在一些情况下，富集生物样品中的靶核酸，并且所述靶核酸的长度不同。在一些情况下，使用一种或多种探针来富集所述生物样品中的靶核酸。在一些情况下，一种或多种探针与靶核酸的一个或多个末端杂交。

Analysis of nucleic acid fragments

This paper provides a method for enriching target nucleic acids in biological samples and analyzing the nucleic acids. In some cases, target nucleic acids associated with cancer or cancer are enriched in biological samples. In some cases, target nucleic acids in biological samples are enriched, and the target nucleic acids are of different lengths. In some cases, one or more probes are used to enrich the target nucleic acid in the biological sample. In some cases, one or more probes hybridize with one or more ends of the target nucleic acid.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析核酸片段的方法交叉引用本申请要求于2016年8月10日提交的美国临时专利申请号62/373,332的权益，该申请通过引用整体并入本文。专利技术背景核酸的扩增和所得扩增产物的分析用于克隆、测序、基因型分型和基因表达。已开发了多种核酸扩增技术，如聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增和基于转录的扩增。遗憾的是，目前的方法在保留核酸末端的序列信息方面是非特异性的。例如，在PCR中，正向和反向寡核苷酸与靶核酸的结合将产生具有对应于正向与反向寡核苷酸之间的靶核酸序列的序列的扩增子。在许多情况下，正向和反向寡核苷酸可在除靶核酸末端外的区域结合，从而产生比该靶核酸更短的扩增子(例如，丢失靶核酸末端的序列信息)。然而，核酸片段(例如，无细胞核酸片段)末端处的序列信息在疾病预测和诊断中可能非常有用。因此，本公开内容提供了用于富集和扩增样品中的靶核酸、同时保留靶核酸末端处的序列信息的方法。核酸扩增和所得扩增产物(例如，扩增子)的后续分析可以在包括分子克隆、测序、基因型分型和基因表达在内的许多分子测定中进行。当样品含有相对少量的起始模板材料(例如，核酸)时，扩增可能特别有用。多个报道指出血浆中的循环无细胞DNA(cfDNA)可能是非随机片段化的。血浆中极低浓度的cfDNA(10-5000个基因组/ml)可使片段化模式的研究和检测变得困难。虽然已经开发了诸如全基因组扩增(WGA)等技术来扩增少量核酸，但扩增子可能比产生出扩增子的模板片段更短。在一些情况下，起始模板核酸片段末端处的核苷酸不被复制(例如，这些技术可能无法保留模板核酸片段末端处的序列信息)，并且不能用于确定核酸片段化模式。本公开内容提供了用于扩增核酸分子(例如，无细胞DNA分子)、同时保留分子末端处的序列信息的组合物和方法。此外，本公开内容提供了用于确定扩增(其中保留了核酸分子末端处的序列信息)后的核酸片段化模式的实施方案。
技术实现思路
在一些方面，本公开内容提供了包括通过分析来自受试者的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)片段来鉴别所述受试者中的核酸片段化模式的方法。在一些实施方案中，所述无细胞DNA片段源自正常细胞并且可能来自病变细胞。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者获得所述生物样品。在一些实施方案中，所述方法包括富集所述生物样品。在一些实施方案中，所述方法包括富集所述生物样品中的具有可映射到一个或多个基因座的末端的一组无细胞DNA片段。在一些实施方案中，所述一个或多个基因座与疾病相关。在一些实施方案中，所述富集包括使至少一种探针与所述无细胞DNA片段的每个末端杂交。在一些实施方案中，所述探针包含与所述无细胞DNA片段的至少一个末端互补的给定序列。在一些实施方案中，所述探针的给定序列的每个核苷酸与所述无细胞DNA片段杂交。在一些实施方案中，所述方法包括对该组富集的无细胞DNA片段或其衍生物进行测序以获得多个序列。在一些实施方案中，所述方法包括将所述多个序列与参考进行比对以确定所述多个序列的基因组位置。在一些实施方案中，所述基因组位置包括对应于所述无细胞DNA片段的末端的位置。在一些实施方案中，所述方法包括鉴别所述多个序列中具有特定片段化模式的一组基因座。在一些实施方案中，该组基因座对应于与所述疾病相关的一个或多个基因座。在一些实施方案中，所述方法包括对获得的生物样品进行酶促操作。在一些实施方案中，对该组无细胞DNA片段进行测序不包括对富集的无细胞DNA片段进行DNA扩增的步骤。在一些实施方案中，鉴别一组基因座包括将所述多个序列与参考基因组进行比较以鉴别具有特定片段化模式的该组基因座。在一些实施方案中，在该组基因座的每个基因座处，相对于所述参考基因组具有序列变异的序列的数目高于阈值。在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。在一些实施方案中，所述病变细胞包括肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述多个序列为多个序列读取。在一些方面，本公开内容提供了包括通过分析来自受试者的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)片段来鉴别所述受试者中的核酸片段化模式的方法。在一些实施方案中，所述无细胞DNA片段源自正常细胞并且可能来自病变细胞。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者获得所述生物样品。在一些实施方案中，所述方法包括通过探针捕获来富集所述生物样品中的具有可映射到一个或多个基因座的末端的一组无细胞DNA片段。在一些实施方案中，所述一个或多个基因座与疾病相关。在一些实施方案中，所述富集包括使至少一种探针与所述无细胞DNA片段的每个末端杂交。在一些实施方案中，所述探针包含与所述无细胞DNA片段的至少一个末端互补的给定序列。在一些实施方案中，所述探针的给定序列的每个核苷酸与所述无细胞DNA片段杂交。在一些实施方案中，所述方法包括鉴别该组富集的无细胞DNA片段中具有特定片段化模式的一组基因座。在一些实施方案中，通过阵列杂交鉴别该组基因座。在一些实施方案中，通过核酸扩增鉴别该组基因座。在一些实施方案中，所述核酸扩增包括聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些方面，本公开内容提供了包括扩增来自受试者的生物样品中的无细胞核酸分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将衔接子连接到来自所述受试者的生物样品的所述无细胞核酸分子的每个末端。在一些实施方案中，所述衔接子包含用于限制性内切核酸酶的识别序列。在一些实施方案中，所述限制性内切核酸酶能够在所述衔接子与所述无细胞核酸分子的末端之间的连接处切割。在一些实施方案中，所述方法包括使用在所述无细胞核酸分子的每个末端处的衔接子扩增在每个末端处包含衔接子的所述无细胞核酸分子，以生成在每个末端处包含衔接子的扩增的无细胞核酸分子。在一些实施方案中，所述方法包括使用所述限制性内切核酸酶将至少一个衔接子与在每个末端包含衔接子的所述扩增的无细胞核酸分子的至少一个末端分离。在一些实施方案中，所述分离发生在所述衔接子与所述无细胞核酸分子的末端之间的连接处。在一些实施方案中，所述无细胞核酸分子是双链的。在一些实施方案中，所述限制性内切核酸酶是II型核酸酶。在一些实施方案中，所述II型核酸酶选自BtsCI、FOKI、AP内切核酸酶和S1内切核酸酶。在一些实施方案中，所述样品中的所述无细胞核酸分子的浓度为每毫升约10至10000个基因组。在一些实施方案中，所述生物样品选自全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、血沉棕黄层及其组合。在一些实施方案中，所述方法包括修复来自所述受试者的生物样品的所述无细胞核酸分子的一个或多个末端。在一些实施方案中，所述修复包括使所述无细胞核酸分子的一个或多个末端中的至少一个平端化，以包含末端5′-磷酸基团和3′-羟基基团中的至少一种。在一些实施方案中，所述修复进一步包括在所述无细胞核酸分子的一个或多个末端处附接脱氧腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述衔接子是双链的。在一些实施方案中，所述方法包括使至少一种探针与所述扩增的无细胞核酸分子的每个末端杂交。在一些实施方案中，所述探针包含与所述扩增的无细胞核酸分子的至少一个末端互补的给定序列。在一些实施方案中，所述探针的给定序列的每个核苷酸与扩增的无细胞核酸分子杂交。在一些实施方案中，所述方法包括对所述扩增的无细胞核酸分子进行测序。在一些实施方案中，所述方法包括对所述扩增的无本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过分析来自受试者的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)片段来鉴别所述受试者中的核酸片段化模式的方法，所述无细胞DNA片段源自正常细胞并且可能来自病变细胞，所述方法包括：(a)从所述受试者获得所述生物样品；(b)富集所述生物样品中的一组无细胞DNA片段，所述无细胞DNA片段具有可映射到与疾病相关的一个或多个基因座的末端，其中所述富集包括使至少一种探针与所述无细胞DNA片段的每个末端杂交，其中所述探针包含与所述无细胞DNA片段的至少一个末端互补的给定序列，并且其中所述探针的所述给定序列的每个核苷酸与所述无细胞DNA片段杂交；(c)对(b)中富集的该组无细胞DNA片段或其衍生物进行测序以获得多个序列；(d)将所述多个序列与参考进行比对以确定所述多个序列的基因组位置，所述基因组位置包括对应于所述无细胞DNA片段的末端的位置；以及(e)鉴别所述多个序列中具有特定片段化模式的一组基因座，其中该组基因座对应于所述与疾病相关的一个或多个基因座。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.10 US 62/373,3321.一种通过分析来自受试者的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)片段来鉴别所述受试者中的核酸片段化模式的方法，所述无细胞DNA片段源自正常细胞并且可能来自病变细胞，所述方法包括：(a)从所述受试者获得所述生物样品；(b)富集所述生物样品中的一组无细胞DNA片段，所述无细胞DNA片段具有可映射到与疾病相关的一个或多个基因座的末端，其中所述富集包括使至少一种探针与所述无细胞DNA片段的每个末端杂交，其中所述探针包含与所述无细胞DNA片段的至少一个末端互补的给定序列，并且其中所述探针的所述给定序列的每个核苷酸与所述无细胞DNA片段杂交；(c)对(b)中富集的该组无细胞DNA片段或其衍生物进行测序以获得多个序列；(d)将所述多个序列与参考进行比对以确定所述多个序列的基因组位置，所述基因组位置包括对应于所述无细胞DNA片段的末端的位置；以及(e)鉴别所述多个序列中具有特定片段化模式的一组基因座，其中该组基因座对应于所述与疾病相关的一个或多个基因座。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在(a)之后对获得的生物样品进行酶促操作。3.根据权利要求1所述的方法，其中对所述组的无细胞DNA片段进行测序不包括对(b)中富集的无细胞DNA片段进行DNA扩增的步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其中(e)包括将所述多个序列与参考基因组进行比较，以鉴别具有特定片段化模式的所述组的基因座。5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述组的基因座的每个基因座处，相对于所述参考基因组具有序列变异的序列的数目高于阈值。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病为肿瘤。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述病变细胞包括肿瘤细胞。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个序列为多个序列读取。9.一种通过分析来自受试者的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)片段来鉴别所述受试者中的核酸片段化模式的方法，所述无细胞DNA片段源自正常细胞并且可能来自病变细胞，所述方法包括：(a)从所述受试者获得所述生物样品；(b)通过探针捕获来富集所述生物样品中的一组无细胞DNA片段，所述无细胞DNA片段具有可映射到与疾病相关的一个或多个基因座的末端，其中所述富集包括使至少一种探针与所述无细胞DNA片段的每个末端杂交，其中所述探针包含与所述无细胞DNA片段的至少一个末端互补的给定序列，并且其中所述探针的给定序列的每个核苷酸与所述无细胞DNA片段杂交；以及(c)鉴别在(b)中富集的该组无细胞DNA片段中具有特定片段化模式的一组基因座。10.根据权利要求9所述的方法，其中通过阵列杂交鉴别所述组的基因座。11.根据权利要求9所述的方法，其中通过核酸扩增鉴别所述组的基因座。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸扩增包括聚合酶链反应(PCR)。13.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病为癌症。14.一种用于扩增来自受试者的生物样品中的无细胞核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将衔接子连接到来自所述受试者的生物样品的所述无细胞核酸分子的每个末端，其中所述衔接子包含用于限制性内切核酸酶的识别序列，其中所述限制性内切核酸酶能够在所述衔接子与所述无细胞核酸分子的末端之间的连接处切割；(b)使用在所述无细胞核酸分子的每个末端处的所述衔接子扩增在每个末端处包含衔接子的所述无细胞核酸分子，以生成在每个末端处包含衔接子的扩增的无细胞核酸分子；以及(c)使用所述限制性内切核酸酶将至少一个衔接子与在每个末端包含衔接子的所述扩增的无细胞核酸分子的至少一个末端分离，其中所述分离发生在所述衔接子与所述无细胞核酸分子的末端之间的连接处。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述无细胞核酸分子是双链的。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述限制性内切核酸酶是II型核酸酶。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述II型核酸酶选自BtsCI、FOKI、AP内切核酸酶和S1内切核酸酶。18.根据权利要求14所述的方法，其中所述样品中的所述无细胞核酸分子的浓度为每毫升约10至10000个基因组。19.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物样品选自全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、血沉棕黄层及其组合。20.根据权利要求14所述的方法，进一步包括修复来自所述受试者的生物样品的所述无细胞核酸分子的一个或多个末端。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述修复包括使所述无细胞核酸分子的一个或多个末端中的至少一个平端化，以包含末端5′-磷酸基团和3′-羟基基团中的至少一种。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述修复进一步包括在所述无细胞核酸分子的一个或多个末端处附接脱氧腺苷核苷酸。23.根据权利要求14所述的方法，其中所述衔接子是双链的。24.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧金尼·纳姆萨拉伊夫，马尼什·简恩，
申请(专利权)人：格瑞尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US