一种抑制害虫免疫反应的苦瓜素类化合物及其高效制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制害虫免疫反应的苦瓜素类化合物及其高效制备方法和应用。本制备方法利用甲醇浸提苦瓜，进行三级高效液相色谱分离得到三种化苦瓜素类化合物：苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。本发明专利技术利用柱过载临界点的多级液相色谱分离化合物，采用三级高效液相色谱分离，大大缩短高效液相色谱分离所需的总时间，提纯过程耗时短、效率高，能定向高效大量地提纯制备高纯度的苦瓜素类化合物。所得的苦瓜素类化合物能有效的抑制多种农业害虫的免疫反应，从而控制农业害虫的种群增长，可以用于绿色健康防控害虫杀虫剂的应用。

A Momordicin Compound Inhibiting the Immune Response of Pests and Its Efficient Preparation and Application

The invention discloses a bitter melon hormone compound which inhibits the immune response of pests and an efficient preparation method and application thereof. The preparation method uses methanol to extract balsam pear and separates three chemical compounds of balsam pear by three-stage high performance liquid chromatography: balsam pear element II, balsam pear element L and balsam pear element I. The invention separates compounds by multi-stage liquid chromatography at the critical point of column overload and adopts three-stage high performance liquid chromatography to separate, greatly shortening the total time required for high performance liquid chromatography separation, and the purification process is time-consuming, high efficiency, and directional, efficient and large-scale preparation of high purity momordin compounds. The obtained momordin compounds can effectively inhibit the immune response of many agricultural pests, thus controlling the population growth of agricultural pests, and can be used in the application of green health pesticides for pest control.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制害虫免疫反应的苦瓜素类化合物及其高效制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种抑制害虫免疫反应的苦瓜素类化合物及其高效制备方法和应用。
技术介绍
苦瓜(MomordicacharantiaL.)葫芦科苦瓜属蔓性草本植物，苦瓜性苦味寒，具有清热解毒，在医学抗突变和抗肿瘤等作用；在食品加工业和生物防治中，有抗虫，抗菌及抗病毒作用。苦瓜素类化合物对脊椎动物安全无害，原材料绿色环保，易获取等特点，是一种非常具有发展潜力的植物次生代谢产物。近几年来苦瓜已成为国内外众多学者的研究热点，并陆续从苦瓜果实和种子分离纯化出蛋白类化合物包括植物蛋白、苦瓜凝集素、α-苦瓜素、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、苦瓜素L、苦瓜素I和苦瓜素II、抗病毒蛋白MAP30、苦瓜啶和苦瓜抑制剂等多种物质。专利技术人科研团队一直致力于苦瓜素类化合物的提纯及化合物的分离鉴定。目前已经发现苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ对小菜蛾幼虫有较强拒食作用并严重抑制其生长发育；苦瓜素类化合物可显著抑制亚洲玉米螟的生长发育及生殖能力；苦瓜素Ⅰ、苦瓜素L可显著抑制亚洲玉米螟幼虫体内的磷脂酶、海藻糖酶等活性；苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ可显著抑制亚洲玉米螟的离体酚氧化酶活性；苦瓜素类化合物可严重破坏斜纹夜蛾卵巢细胞的正常生理；苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B对亚洲玉米螟Ofh细胞均具有有效的增殖抑制和致坏死作用。由此可见，苦瓜素类化合物对农业害虫的防治具有重要意义。目前，从苦瓜茎叶提取物中获得了8种苦瓜素类化合物，其中，苦瓜素Ⅰ，苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L在苦瓜素类化合物中占比可达36.38％。但是苦瓜素类化合物在纯化中获得率低，纯化步骤繁琐，耗时过长。目前，提取苦瓜素类化合物的一般方法包括梯度萃取、硅胶柱层析以及高效液相色谱分离等。以凌冰提取苦瓜素类化合物的方法为例(表1所示)，具体步骤为乙醇浸提苦瓜茎叶，梯度萃取，硅胶柱层析，然后将获得的提取物进行单级高效液相色谱分离，最终得到纯度为95％以上的苦瓜素类化合物，提取过程总耗时约为121h，总提取率约为100mg/kg，产率约为0.83mg/h。梯度萃取需要多种有机溶剂，在多个萃取步骤中，苦瓜素类化合物的回收率都受到较大的损失；硅胶柱层析步骤繁琐，成本高，耗时长，且分辨率不高；传统的高效液相色谱分离法虽然能可以获得纯度达95％以上苦瓜素类化合物，但总耗时长，总提取效率低，不适用于大量制备苦瓜素类化合物。由于目前缺乏一种简单高效的苦瓜素化合物的分离纯化方法，严重制约了利用苦瓜素类化合物开发食品级纯度的药物或一种高效的生物源性杀虫剂。表1：多酚氧化酶(PPO)具有黑化抵御入侵病原微生物的作用，是昆虫免疫反应的重要组成部分。酚氧化酶原级联激活系统普遍存在于所有无脊椎动物中，它是昆虫最重要的体液免疫系统之一。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活，而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来氧化外源物。抑制过氧化物酶活性可以导致昆虫防御机制的废除或机体异常软化，两者都可能导致病虫害的防治，所以将酚氧化酶(PO)作为新型杀虫剂的靶点具有新的、合理的作用模式，通过抑制酚氧化酶(PO)活性而使害虫失去正常的防御能力或软化为异常而达到防控害虫的目的。专利技术人科研团队发现苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ可显著抑制亚洲玉米螟的离体酚氧化酶活性，但是尚不清楚苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ在转录和翻译水平是如何抑制酚氧化酶(PO)活性的，因此制约了拓宽以害虫酚氧化酶原级联激活系统为靶标的苦瓜素类杀虫剂的开发和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术缺乏一种简单高效的苦瓜素化合物的分离纯化方法的不足，提供一种高效快速制备苦瓜素类化合物的方法及应用(流程如图1)。本专利技术的第一个目的是提供一种高效快速制备苦瓜素类化合物的方法。本专利技术的第二个目的是提供所述苦瓜素类化合物中的一种或几种在杀虫和/或制备杀虫剂中的应用。本专利技术的第三个目的是提供所述苦瓜素类化合物中的一种或几种在抑制免疫反应、抑制酚氧化酶和/或抑制酚氧化酶原激活酶，和/或制备免疫反应、酚氧化酶和/或抑制酚氧化酶原激活酶的抑制剂中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种杀虫剂、免疫反应抑制剂、酚氧化酶和/或酚氧化酶原激活酶的抑制剂。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种苦瓜素类化合物的制备方法，甲醇浸提苦瓜，进行三级高效液相色谱分离。优选地，制备方法包括以下步骤：S1.新鲜苦瓜茎叶干燥，研磨成粉；S2.用甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提，浸提液过滤浓缩，得到粗提物；S3.对粗提物进行一级高效液相色谱分离，分别收集18～26min时间段和30～42min时间段的流出液，浓缩，即得一级分离物1和一级分离物2；S4.分别对一级分离物1和一级分离物2进行二级高效液相色谱分离，对于一级分离物1分别收18～22min时间段和24～26min时间段的流出液，干燥浓缩，得二级分离物1-1和二级分离物1-2，对于一级分离物2收集33～37min时间段的流出液，干燥浓缩，得二级分离物2-1；S5.分别对二级分离物1-1、二级分离物1-2、二级分离物2-1进行三级高效液相色谱分离，分别收集20～24min时间段、23～26min时间段以及34～37min时间段的流出液，干燥浓缩，分别得到苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。优选地，高效液相色谱分离的的参数为：流动相为80％甲醇、柱温度为28℃、流速为2.5mL/min、分离柱为AgilentXB-C18、检测波长为210nm。优选地，所述用甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提为用80～100％甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提16～26h。更优选地，用100％甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提24h，可以显著提高提取率。优选地，甲醇与苦瓜茎叶干粉的用量比为1:5～10(g:mL)。更优选地，甲醇与苦瓜茎叶干粉的用量比为1:5(g:mL)，可以显著提高提取率。本专利技术利用柱过载临界点的多级液相色谱分离获得化合物，利用柱过载临界点确定最优HPLC进样量。因此，优选地，一级高效液相色谱的上样量与浸提液甲醇的体积比为1～3：2～10；二级高效液相色谱的上样量与一级分离物1或一级分离物2的体积比为1～3：2～10；三级级高效液相色谱的上样量与二级分离物1-1、二级分离物1-2或二级分离物2-1的体积比为1～3：2～10。更优选地，一级高效液相色谱的上样量与浸提液甲醇的体积比为2：5。更优选地，二级高效液相色谱的上样量与一级分离物1或一级分离物2的体积比为2：5。更优选地，三级级高效液相色谱的上样量与二级分离物1-1、二级分离物1-2或二级分离物2-1的体积比为2：5。优选地，步骤S3中，一级分离物1和一级分离物2分别浓缩至1mL。优选地，步骤S4中，二级分离物1-1、二级分离物1-2和二级分离物2-1分别浓缩至1mL。优选地，步骤S2中，所述过滤为用0.22μm滤膜过滤。进一步，最优选地，包括以下步骤：S1.新鲜苦瓜茎叶干燥，研磨成粉；S2.用100％甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提24h，浸提液用0.22μm滤膜过滤浓缩，得到粗提物，其中甲醇与苦瓜茎叶干粉的用量比为1:5(g:mL)；S3.对粗提物进行一级高效液相色谱分离，分别收集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苦瓜素类化合物的制备方法，其特征在于，甲醇浸提苦瓜，进行三级高效液相色谱分离。

【技术特征摘要】
1.一种苦瓜素类化合物的制备方法，其特征在于，甲醇浸提苦瓜，进行三级高效液相色谱分离。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.新鲜苦瓜茎叶干燥，研磨成粉；S2.用甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提，浸提液过滤浓缩，得到粗提物；S3.对粗提物进行一级高效液相色谱分离，分别收集18～26min时间段和30～42min时间段的流出液，浓缩，即得一级分离物1和一级分离物2；S4.分别对一级分离物1和一级分离物2进行二级高效液相色谱分离，对于一级分离物1分别收18～22min时间段和24～26min时间段的流出液，干燥浓缩，得二级分离物1-1和二级分离物1-2，对于一级分离物2收集33～37min时间段的流出液，干燥浓缩，得二级分离物2-1；S5.分别对二级分离物1-1、二级分离物1-2、二级分离物2-1进行三级高效液相色谱分离，分别收集20～24min时间段、23～26min时间段以及34～37min时间段的流出液，干燥浓缩，分别得到苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，高效液相色谱分离的的参数为：流动相为80%甲醇、柱温度为28℃、流速为2.5mL/min、分离柱为Ag...

【专利技术属性】
技术研发人员：许小霞，张展滔，金丰良，林晓菊，叶凯翔，郑锦龙，孔锦荣，张茂新，凌冰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44