一种感音神经性耳聋致病基因GJB2突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种感音神经性耳聋致病基因GJB2突变检测试剂盒。试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明专利技术所述试剂盒检测患者是否存在GJB2基因c.2T>G突变，从而诊断感音神经性耳聋发生的原因，该试剂盒将有利于临床上开展感音神经性耳聋患者的GJB2突变筛查工作，为感音神经性耳聋患者的诊断提供依据。

A Kit for Detecting Mutation of GJB2 Gene in Sensorineural Deafness

The invention discloses a mutation detection kit for the pathogenic gene GJB2 of sensorineural deafness. The kit includes reagents for extracting DNA from the sample to be tested, PCR reaction reagents for amplifying the sample DNA, and reagents for sequencing the amplified products of the PCR. The PCR reaction reagents for amplifying the sample DNA include PCR primers. The kit can be used to detect whether there is c.2T>G mutation of GJB2 gene in patients, thereby diagnosing the cause of sensorineural deafness. The kit will be helpful for clinical screening of GJB2 mutation in patients with sensorineural deafness, and provide a basis for diagnosis of patients with sensorineural deafness.

【技术实现步骤摘要】
一种感音神经性耳聋致病基因GJB2突变检测试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及在临床诊断感音神经性耳聋中应用的GJB2基因单个突变位点c.2T>G(p.M1R)分型检测试剂盒。
技术介绍
GJB2基因是最常见的耳聋基因。GJB2基因编码的Cx26属于缝隙连接蛋白基因家族，该基因于1993年被克隆，定位于13q11-12。1997年有学者发现GJB2基因突变与遗传性非综合征型耳聋密切相关。GJB2基因编码的Cx26与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，该通道对信号传导和物质交换起着重要作用，也是电解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道，耳蜗毛细胞和耳蜗内淋巴液的钾离子循环受上述缝隙连接通道调控。钾离子通过缝隙连接通道进入血管纹，由中间细胞释放进入血管纹间隙，在此处返回内淋巴。致聋原因可能是GJB2基因编码区的突变导致蛋白质翻译出现截短蛋白，产生无功能的蛋白质，影响缝隙连接蛋白的结构，从而影响上述通道的正常开闭；也可能产生非截短突变，不影响蛋白的表达，但会影响缝隙连接蛋白的通透性；缝隙连接通道的异常，可导致钾离子回流内淋巴液的循环受到影响，钾离子浓度发生改变，达到一定浓度会导致钾中毒，耳蜗毛细胞损伤，导致感音神经性耳聋，而且大多数人表现为先天性耳聋，且多表现为重度或极重度感音性耳聋。研究表明，在常染色体隐性遗传性非综合征型耳聋患者中，约有50％为GJB2基因突变引起。对于感音神经性耳聋患者GJB2基因突变的筛查，国内外已经广泛开展，报道的致病突变位点超过100个，包括错义突变、框移突变、无义突变及剪接位点突变，主要分布在编码区范围内。GJB2基因具有明显的异质性，不同种族其突变形式不完全相同，突变热点存在种族差异，据统计在中国耳聋患者中21％为GJB2基因突变所致，最常见的突变方式为233～235delC。据800例人工耳蜗植入患者统计，发现191例GJB2基因突变，检出率约23.88％。GJB2基因在先天性耳聋遗传因素中占主导地位，GJB2基因突变的发现，不仅会促进该病的发病机理等基础研究的发展，还将大大促进感音神经性耳聋的基因诊断和治疗的开展。临床分子诊断可以提供准确的表型预测，特别是对新生儿的基因型筛查，可以对听力状况进行及早诊断以便早期干预。通过产前诊断筛查及新生儿GJB2基因突变的普遍筛查，可以降低感音神经性耳聋患儿的出生率，预防耳聋出生缺陷、实现耳聋的有效预防和低成本治疗，从而降低耳聋发生率、提高患者生存质量。GJB2基因是常见的耳聋基因，但它的各个位点突变后的效果是不同的，有些位点突变后是多态，有些位点突变后是隐性遗传，有些位点突变后是显性遗传，有些位点突变成不同的碱基都会是不同的遗传方式。所以虽然患者可能都是GJB2基因突变引起的耳聋，还是要区分是哪个位点发生了突变，是显性或隐性，从而为后期该患者家庭中的产前诊断提供依据。由于GJB2基因的突变种类多样，每个位点变异后对蛋白的功能影响不同，增加了明确新的突变位点致病性的难度。目前尚未见关于GJB2基因c.2T>G(p.M1R)突变的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种感音神经性耳聋致病基因GJB2突变检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种用于检测GJB2基因c.2T>G(p.M1R)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人GJB2基因CDS区(参考序列基因ID：2706)第2位所对应的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：GJB2-F-1:5’-ATGACAAACTAAGTTGGTTCTGTC-3’；GJB2-R-1:5’-AATCTTTGTGTTGGGAAATGC-3’。优选的，所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的序列为：GJB2-F-2:5’-GACATCTTATCCTCACGGTTCT-3’；GJB2-R-2:5’-CAACGAGGATCATAATGCGAA-3’。利用上述试剂盒检测GJB2基因c.2T>G(p.M1R)突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人GJB2基因CDS区(参考序列基因ID：2706)第2位的碱基进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与所述参考序列进行比对，确定待测个体对应于人GJB2基因CDS区(参考序列基因ID：2706)第2位的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型T/T、突变杂合型T/G或突变纯合型G/G。上述试剂盒在感音神经性耳聋病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的GJB2基因片段)中对应于人GJB2基因参考序列编码区第2位是否存在c.2T>G突变，从而判断该患者感音神经性耳聋发生的遗传性原因。其中，GJB2基因发生c.2T>G突变为错义突变，导致GJB2基因编码的第1位的氨基酸由蛋氨酸变成精氨酸(p.M1R)即开放阅读框的起始密码子发生了改变，整个蛋白序列不能正常表达。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术所提出的试剂盒可用于快速地检测GJB2基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在GJB2基因c.2T>G突变，可以判断该患者的感音神经性耳聋发生原因，进而为临床诊断提供依据。本专利技术所提出的试剂盒在用于感音神经性耳聋的诊断时：1)本专利技术将为在感音神经性耳聋患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.2T>G纯合突变或者该位点与其他明确的隐性致病位点的复合杂合突变，降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担。进一步的，本专利技术所提供的具体引物序列对于GJB2基因片段的扩增效率更高。附图说明图1为GJB2基因编码区(序列是反向的)氨基酸的保守性分析：突变位于GJB2基因CDS区第2位的T碱基，用方框圈起来的是突变前氨基酸。图2为PCR反应流程图：示出了反应条件(反应温度和时间)，其中↓表示每个循环降低0.5℃。图3A为待测个体GJB2基因测序结果图：突变杂合型序列，箭头所指为突变位点位置。图3B为待测个体GJB2基因测序结果图：野生型序列，箭头所指为突变位点位置。图4为扩增产物的电泳图谱：泳道1为Marker，泳道2为扩增的目标序列(976bp)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作详细说明，以下实施例用于解释本专利技术，而非对本专利技术保护范围的限制。本专利技术应用候选基因筛查的方法对100例非综合征型感音神经性耳聋患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例非综合征型感音神经性耳聋患者发现GJB2基因的c.2T>G突变。该患者的听力学检测结果是极重度听力损失，CT和MRI结果未显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含GJB2基因CDS区第2位所对应的碱基。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含GJB2基因CDS区第2位所对应的碱基。2.根据权利要求1所述一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。3.根据权利要求1所述一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。4.根据权利要求1所述一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P1，引物对P1的序列为：GJB2-F-1:5’-ATGACAAACTAAGTTGGTTCTGTC-3’；GJB2-R-1:5’-AATCTTTGTGTTGGGAAATGC-3’。5.根据权利要求1所述一种用于检测GJB2基因c.2T>G突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自引物对P2，引物对P2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：查定军，王淑娟，陈俊，梁鹏飞，王剑，李琼，安晓刚，李薇，邱建华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61