听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒，试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。使用本发明专利技术所述试剂盒检测患者中是否存在OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp缺失突变，从而诊断听神经病谱系障碍发生的原因。该试剂盒将有利于临床上开展听神经病谱系障碍患者的OTOF突变筛查工作，为听神经病谱系障碍患者的诊断提供依据。

OTOF gene mutation detection kit related to auditory neuropathy pedigree disorder

The invention discloses an OTOF gene mutation detection kit related to auditory neuropathy pedigree disorder, which comprises a reagent for extracting DNA from the tested sample, a PCR reaction reagent for amplifying DNA of the sample, and a reagent for sequencing the amplified products of the PCR; the PCR reaction reagent for amplifying DNA of the sample includes a PCR primer. The kit of the invention is used to detect whether there is an OTOF gene NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp deletion mutation in patients, thereby diagnosing the cause of the occurrence of auditory neuropathy pedigree disorder. The kit will be helpful for OTOF mutation screening in patients with auditory neuropathy spectrum disorder, and provide a basis for the diagnosis of patients with auditory neuropathy spectrum disorder.

【技术实现步骤摘要】
听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及在诊断听神经病/听神经病谱系障碍中应用的OTOF基因突变c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)分型检测试剂盒。
技术介绍
听神经病(auditoryneuropathy,AN)是耳蜗内毛细胞、听神经突触或听神经功能不良所导致的听力障碍。它是导致婴幼儿和青少年语言交流障碍的重要疾病，在每年新发的听力损失患儿中约占8％，其发病与遗传因素密切相关。听神经病依据发病部位分为两型：Ⅰ型听神经病为突触后型；Ⅱ型听神经病为突触及突触前型。人工耳蜗植入对于双耳重度感音神经性耳聋患者，是最好的治疗选择，但仅对Ⅱ型听神经病有效。听神经病诊断依靠听力学及影像学检查，但依据听力学检查结果无法进行分型，目前致病基因型是分型的主要依据。与Ⅱ型听神经病谱系障碍相关的基因主要是OTOF基因。OTOF(otoferlin)基因是第一个克隆的与非综合征型听神经病相关的基因，位于2p23的DFNB9基因座内。OTOF基因DNA序列全长101496bp，共有4种长短不同的转录本变异体。其中最长的亚型包含48个外显子，编码氨基酸长度为1997aa的蛋白质Otoferlin。Yasunaga等对多个常染色体隐性非综合征型语前聋家系进行候选基因研究，发现三个家系共21名患病成员的OTOF基因都在第18个外显子发生无义突变，提前生成终止密码子并形成截短蛋白，致使其编码的Otoferlin蛋白不完整。在内耳中，Otoferlin蛋白在成熟的耳蜗中只表达于内毛细胞，且大多表达于内毛细胞基底外侧部。该蛋白是一种钙离子感受器，基因突变可导致内毛细胞活动区囊泡的胞吐作用被抑制，神经递质释放减少，进而引起神经冲动的减少；此外，神经递质可能对突触后神经纤维有营养作用，如营养作用的减弱可导致突触后膜产生退行性病变，或许可以解释听神经病谱系障碍(ANSD)患者渐进性听力损失的特点。根据文献报道OTOF基因突变在世界范围内广泛存在于SNHL人群中，同时也是ANSD患者的主要致病突变。根据文献统计我国汉族ANSD患者中约5.5％的散发病例可将病因归于OTOF基因的突变。不同地区和种族ANSD人群的突变谱还不完善，目前已知的OTOF基因突变类型有100余种，绝大多数为无义突变、截短突变或移码突变。OTOF基因是目前研究最为广泛和深入的ANSD相关基因。综合国内外文献报道的治疗经验，相比传统助听器和药物治疗，人工耳蜗植入的干预效果更为确切，但差异很大，具体到个体患者的选择仍需谨慎。以往研究认为可参考以下几个方面预测植入后的效果：1、术前MRI如发现中枢系统病变，可能预示术后效果不佳，尤其是有蜗神经缺失或形态异常时；2、基因突变类型与术后疗效的关系还不确定，现有研究结果可作为参考，通常认为OTOF突变引起突触前病变导致的ANSD术后效果较好，推测是人工耳蜗提供的直接电刺激绕过了病变部位，而轴突损伤导致突触后病变和涉及听神经全程的病变(如遗传性共济失调症和耳聋-肌张力不全症-视神经元病)引起的ANSD术后效果较差。所以明确听神经病/听神经病谱系障碍致病基因，对患者进行分型并评估人工耳蜗的植入效果具有重要意义。目前尚未见到关于OTOF基因缺失突变NM_01287489.1:c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位所对应的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述PCR引物选自以下三对引物P1、P2、P3中的一对：引物对P1的序列为：OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；引物对P2的序列为：OTOF-F-2:5’-CCAACCCTCAGCTCCACCTA-3’；OTOF-R-2:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；引物对P3的序列为：OTOF-F-3:5’-GGGGACACGGGCTAATGCT-3’；OTOF-R-3:5’-GCTCCTGTCCTTGTCTGTGCC-3’。利用上述试剂盒检测OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，以上述PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；从PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段，并根据该目标片段中对应于人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的碱基缺失情况进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与参考序列(GeneID:9381)进行比对，确定待测个体对应于人OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型W/W、突变杂合型W/D或突变纯合型D/D，其中W:野生型；D:缺失。上述试剂盒在听神经病谱系障碍病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的OTOF基因片段)中对应于人OTOF基因CDS区(NM_01287489.1)第1945-1960位是否存在c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，从而判断该患者听神经病谱系障碍发生的遗传性原因。其中，OTOF基因发生c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，使氨基酸序列自649位发生移码改变，并使氨基酸的编码提前终止于第660位的氨基酸(p.R649Gfs*11)，形成Otoferlin的截短肽链，丧失其功能，不成熟的表达产物诱导启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术所提出的试剂盒可用于快速地检测OTOF基因特定突变位点，通过检测来自患者的DNA样本中是否存在OTOF基因c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)缺失突变，可以判断该患者听神经病谱系障碍发生原因，进而为临床诊断提供依据。本专利技术所提出的试剂盒在用于听神经病谱系障碍的诊断时：1)本专利技术将为在听神经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)通过产前诊断筛查，明确胎儿是否携带c.1945_1960del16bp(p.R649Gfs*11)突变，降低聋儿的出生率，为社会和家庭减轻负担；3)将有利于为不同类型听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案，避免人工耳蜗植入无效而造成的不必要的经济损失。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位所对应的碱基。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括PCR引物，该PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因NM_01287489.1:c.1945_1960位所对应的碱基。2.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。3.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。4.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.1945_1960del16bp突变的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物选自以下三对引物P1、P2、P3中的一对：引物对P1的序列为：OTOF-F-1:5’-AGGCAGCACCGGATTGGA-3’；OTOF-R-1:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT-3’；引物对P2的序列为：OTOF-F-2:5’-CCAACCCTCAGCTCCACCTA-3’；OTOF-R-2:5’-CCAGGTAGGGCAGATGGAAGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：查定军，王淑娟，陈俊，梁鹏飞，王剑，李琼，李薇，邱建华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61