一种胺脱氢酶电极及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种胺脱氢酶电极及其制备方法和应用。本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用。该电极包括基底电极、电子传导层和胺脱氢酶层，可实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的电子转移，提高酶分子催化活性和传感器的灵敏度。本发明专利技术的酶电极以具有良好生物相容性的导电高分子聚乙烯亚胺修饰石墨烯、碳纳米管做电极材料，具有制作方法简单、检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好的优点，具有良好的应用前景。

An Amine Dehydrogenase Electrode and Its Preparation and Application

The invention discloses an amine dehydrogenase electrode, a preparation method and application thereof. The invention relates to the technical field of biosensors, in particular to an enzyme electrode, an enzyme biosensor, a preparation method and application thereof. The electrode consists of a base electrode, an electron conducting layer and an amine dehydrogenase layer, which can effectively immobilize the enzyme molecule and transfer the electrons between the enzyme and the electrode to improve the catalytic activity of the enzyme molecule and the sensitivity of the sensor. The enzyme electrode of the invention uses conductive polymer polyethyleneimine modified graphene and carbon nanotubes with good biocompatibility as electrode materials. The enzyme electrode has the advantages of simple preparation method, high detection sensitivity, fast and accurate, good stability and repeatability, and has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种胺脱氢酶电极及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物传感器
，涉及一种酶电极、酶生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种胺脱氢酶电极及其制备方法和应用。
技术介绍
生物传感器在生物医学检验、疾病诊断与治疗、食品分析、环境监测、工业过程检测与控制、毒物检测及战争生化预警等领域具有广阔的应用前景。生物传感技术产业化的瓶颈是关键器件和分析系统制造技术。以酶分子器件为重点，在分子设计、器件组装、分析模型构建等方面进行创新设计并在医疗、环境、工业等重点领域进行应用示范是生物传感器的研究热点。目前，芳香胺类化合物的分析方法主要有毛细管电泳法、高效液相色谱法和气相色谱法。这些方法由于需要复杂的样品前处理过程及庞大的仪器，难以满足有机胺物质的小型化、快速化和现场化的检测要求。酶电极则具有准确、快速、简便、灵敏和选择性好等优点，为芳香胺物质的测定提供了一种有效的手段，如Munteanu等把辣根过氧化物酶和葡萄糖脱氢酶包埋在石墨复合电极中制备酶电极测定芳香胺物质。杨绍明等利用HRP/GOx双酶电极体系中催化芳香胺物质进行检测。胺脱氢酶可高效催化胺脱氨生成相应的酮，同时将NAD+还原为NADH(图1)。反应过程简洁高效，在有机胺的酶检测具有广阔的应用潜力。然而，目前利用胺脱氢酶构建酶电极进行检测还未见报道。究其原因，目前已报道的高效胺脱氢酶较少。而有机胺往往难溶于水，适于在有机相中进行检测，需开发适用于有机相的酶电极测定疏水性有机胺，特别是芳香胺。而脱氢酶往往对有机溶剂的耐受性较差，容易失活，严重制约胺脱氢酶电极的开发。支链以及直链聚乙烯亚胺上的大量氨基，不仅可以与碳纳米材料结合，也可以和蛋白酶氨基酸侧链氨基酸(组氨酸、天冬氨酸和精氨酸等)上的功能基团(咪唑基、吲哚基和酚羟基等)进行反应。并且聚乙烯亚胺提供生物相容性的微环境。酶与载体的多层次相互作用使胺脱氢酶紧密地结合在电极上，且二者之间也存在范德华力、氢键和静电作用力，可用于高度敏感和选择性的生物传感器。但截至目前还未有将聚乙烯亚胺用于制备胺脱氢酶电极的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种胺脱氢酶电极及其制备方法和应用，基于碳纳米材料与聚乙烯亚胺(PEI)复合材料的设计，构建基于氢键、疏水、静电和配位作用力等多层次的相互作用力定向组装酶，有利于提高酶的稳定性及生物敏感膜的固定，为生物分子的电化学反应提供了一个良好的微环境，构建得到新型胺脱氢酶电极；同时，本专利技术利用胺脱氢酶电极制备检测胺的生物传感器，并以聚乙烯亚胺高分子材料作为电极辅助材料，具有良好生物相容性且能在酶和电极之间的直接电子转移方面起促进作用，实现酶分子的有效固定和酶与电极之间的电子转移，提高酶分子催化活性和传感器的灵敏度，从而实现对有机胺的高灵敏检测。本专利技术的胺脱氢酶电极与传统的酶电极比较，具有检测灵敏度高、快捷准确、稳定性和重复性好等优势。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种胺脱氢酶电极，包括基底电极、电子传导层和胺脱氢酶层；所述电子传导层为还原氧化石墨烯-PEI复合材料或碳纳米管；所述胺脱氢酶的基因序列如SEQIDNO.1所示。所述胺脱氢酶电极以基底电极为中心，由内到外依次为所述电子传导层和所述胺脱氢酶层。一实施例中：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极；优选为玻碳电极。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种胺脱氢酶电极的制备方法，包括：(1)将氧化石墨烯吸附PEI或氧化石墨烯共价接枝PEI，进行还原得到还原氧化石墨烯-PEI复合材料，所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料再与胺脱氢酶混合固定化；或将碳纳米管与胺脱氢酶混合固定化(利用碳纳米管的空间管径特性，胺脱氢酶可被吸附在碳纳米管上或管径中)；所述胺脱氢酶的基因序列如SEQIDNO.1所示；(2)将还原氧化石墨烯-PEI复合材料固定化胺脱氢酶后的产物或将碳纳米管-PEI复合材料固定化胺脱氢酶后的产物复合于基底电极表面，得到胺脱氢酶电极。一实施例中：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极；优选为玻碳电极。所述基底电极为玻碳电极或热解石墨电极时预先经过表面预处理，表面预处理方法包括：将玻碳电极或热解石墨电极依次用直径1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，再将玻碳电极或热解石墨电极置于含有1～5mMK3Fe(CN)6和10～200mMKCl的溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温下晾干得到预处理的基底电极。一实施例中：所述聚乙烯亚胺是分子量范围为20～500kDa的直链或支链的聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺直接使用或利用pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液，配制成浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液使用。所述聚乙烯亚胺为分子量为22KDa、87KDa或217KDa的直链PEI，或分子量为25KDa或187KDa的支链PEI。一实施例中：所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料制备方法包括：将7～100mL水、50～200mgKOH和150～300mgPEI搅拌均匀，加入4～10mL4～6mg/mL的分散均匀的GO溶液，75～85℃加热回流22～26h后，加入6～10mL1～3mol/L硼氢化钠进行还原，继续反应1～3h；反应完成后，经过离心、干燥即得到还原氧化石墨烯-PEI复合材料rGO-PEI。一实施例中：所述胺脱氢酶的制备方法包括：利用如SEQIDNO.1所示的胺脱氢酶基因制备可表达胺脱氢酶的工程菌；将上述工程菌接种，加入诱导剂，培养所得发酵液离心获得细胞；细胞超声破碎，离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液；将上述含有胺脱氢酶的粗酶液进行纯化除盐，得到胺脱氢酶。一实施例中：所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料与胺脱氢酶混合固定化的制备方法包括：将浓度为0.05～1mg/ml的所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料与浓度为0.05～10mg/ml的胺脱氢酶溶液按照体积比1:1～4的比例混合，6000～10000rpm离心10～20min，冲洗，重悬于0.05～0.1M的pH8.0～10.0的氨水-氯化铵缓冲液中，制备含0.25～50mg/ml胺脱氢酶的混合溶液，即为还原氧化石墨烯-PEI复合材料固定化胺脱氢酶后的产物；或，所述碳纳米管与胺脱氢酶混合固定化的制备方法包括：在富集碳纳米管的载体上添加胺脱氢酶溶液，干燥，反复添加胺脱氢酶溶液和干燥步骤若干次，得到胺脱氢酶-碳纳米管修饰物，即为碳纳米管固定化胺脱氢酶后的产物。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之三是：一种胺脱氢酶电极在测定溶液中的胺浓度上的应用，所述胺浓度的测定采用三电极体系，以所述的胺脱氢酶电极为工作电极，或以根据所述的制备方法所制备的胺脱氢酶电极为工作电极；参比电极为饱和甘汞电极、氢电极、银|氯化银电极或汞|氧化汞电极，更优选为饱和甘汞电极；对电极为铂丝电极或碳电极。一实施例中：以循环伏安和/或计时电流的方式测定溶液中的胺浓度；所述循环伏安方式的测试电位扫描速率为25～200mV/s；在加入1～20mg辅酶NADH的缓冲液中进行，测试之前通入N2，所述胺为苯乙胺、邻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胺脱氢酶电极，其特征在于：包括基底电极、电子传导层和胺脱氢酶层；所述电子传导层为还原氧化石墨烯‑PEI复合材料或碳纳米管；所述胺脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种胺脱氢酶电极，其特征在于：包括基底电极、电子传导层和胺脱氢酶层；所述电子传导层为还原氧化石墨烯-PEI复合材料或碳纳米管；所述胺脱氢酶的基因序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的胺脱氢酶电极，其特征在于：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极。3.一种胺脱氢酶电极的制备方法，其特征在于：包括：(1)将氧化石墨烯吸附PEI或氧化石墨烯共价接枝PEI，进行还原得到还原氧化石墨烯-PEI复合材料，所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料再与胺脱氢酶混合固定化；或将碳纳米管与胺脱氢酶混合固定化；所述胺脱氢酶的基因序列如SEQIDNO.1所示；(2)将还原氧化石墨烯-PEI复合材料固定化胺脱氢酶后的产物或将碳纳米管固定化胺脱氢酶后的产物复合于基底电极表面，得到胺脱氢酶电极。4.根据权利要求3所述的胺脱氢酶电极的制备方法，其特征在于：所述基底电极为玻碳电极、热解石墨电极、碳糊电极或金属电极；所述基底电极为玻碳电极或热解石墨电极时预先经过表面预处理，表面预处理方法包括：将玻碳电极或热解石墨电极依次用直径1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，再将玻碳电极或热解石墨电极置于含有1～5mMK3Fe(CN)6和10～200mMKCl的溶液中进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温下晾干得到预处理的基底电极。5.根据权利要求3所述的胺脱氢酶电极的制备方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺是分子量范围为20～500kDa的直链或支链的聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺直接使用或利用pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液，配制成浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液使用。6.根据权利要求3所述的胺脱氢酶电极的制备方法，其特征在于：所述还原氧化石墨烯-PEI复合材料制备方法包括：将7～100mL水、50～200mgKOH和150～300mgPEI搅拌均匀，加入4～10mL4～6mg/mL的分散均匀的GO溶液，75～85℃加热回流22～26h后，加入6～10mL1～3mol/L硼氢化钠进行还原...

【专利技术属性】
技术研发人员：王世珍，姚光晓，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35