基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)；2)制备dsDNA和DNA探针以及三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的混合液；3)将上述DNA混合液滴加在CdSQDs/GCE表面，采用6‑巯基‑1‑己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；4)制备OTA和切刻内切酶的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；5)利用透射电子显微镜对CdSQDs进行表征。本发明专利技术不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。

Detection of ochratoxin A by electrochemiluminescent aptamer sensor based on DNA walking robot

The invention discloses a method for detecting ochratoxin A based on an electrochemiluminescent aptamer sensor constructed by a DNA walking robot. 1) preparation of double stranded DNA (dsDNA) with specific response to ochratoxin A; 2) preparation of dsDNA and DNA probes and a mixture of tri (2 carboxyethyl) phosphine hydrochloride; 3) addition of the above DNA mixed solution to the surface of CdSQDs/GCE, and closure of the electricity with 6 The electrochemiluminescent aptamer sensor was prepared after non-specific active binding sites on the polar surface. 4) The mixed solution of OTA and endonuclease was prepared, and the mixed droplets were added to the surface of the sensor. The reaction system was detected by electrochemiluminescent analyzer. 5) The CdSQDs were characterized by transmission electron microscopy. The invention does not need precise and expensive experimental instruments, does not have strict and complex experimental operation process, greatly reduces the detection cost of OTA, and has the advantages of high sensitivity, strong anti-interference ability, simple preparation and low cost.

【技术实现步骤摘要】
基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法
本专利技术属于生物传感
，具体涉及一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法。
技术介绍
DNA行走机器人作为一种人工合成的分子机器，它是通过设计特定的DNA序列(DNAwalker)并利用DNAwalker的定向自主移动达到信号放大的目的。由于具有良好的可控性和精密的可预测性以及制备简单、操作方便的优点，DNA行走机器人现已日渐受到关注并应用于分析检测领域。赭曲霉毒素A是一种与人类健康关系最为密切的真菌毒素，其不仅能够严重地污染粮谷类农产品和动物性食品，而且对人类和动物还具有高度的肾毒性、肝毒性、致畸性和致癌性和免疫抑制作用，世界卫生组织国际癌症研究机构已将其划定为2B类致癌物。目前已经有许多检测赭曲霉毒素A的相关报道，但是检测过程复杂，高成本低信号，而且选择性差。因此，提供一种能对赭曲霉毒素A进行特异性识别，具有较高的抗干扰能力，并能对赭曲霉毒素A进行灵敏的定量检测，制备简便且成本低廉的基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器是本专利技术亟需解决的问题。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A，本专利技术不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术先通过OTA与其核酸适体之间的特异性识别作用使aptamer从dsDNA中脱离，然后利用DNAwalker、Cy5-DNA以及Nb.BbvCI构建DNA行走机器人。OTA夺走aptamer之后，DNAwalker能够循环多次地与电极表面的Cy5-DNA进行杂交，导致大量的Cy5-DNA被Nb.BbvCI切割进而远离电极表面，Cy5-DNA对CdSQDs所产生的光信号的猝灭作用减弱，从而引起传感器表面电化学发光信号强度的变化。OTA的加入量越多，传感器表面自由的DNAwalker越多，被切割的Cy5-DNA越多，CdSQDs的电化学发光信号就越强，以此实现OTA的定量检测。本专利技术电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)；2)制备dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液；3)将上述DNA混合液滴加在CdSQDs/GCE表面，采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；4)制备OTA和切刻内切酶(Nb.BbvCI)的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；5)利用透射电子显微镜对CdSQDs/GCE进行表征。其中，进一步的，所述步骤1)赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即aptamer和DNAwalker，在DNA杂交缓冲溶液中95～100℃水浴后冷却至室温，形成杂交的dsDNA。进一步的，所述DNA杂交缓冲溶液为：10mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH7.2～7.4。进一步的，所述步骤2)DNA探针选取一条特定序列的荧光染料修饰的单链DNA；制备dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液具体步骤如下：取一小离心管，依次加入dsDNA溶液、Cy5-DNA溶液和三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，随后加入超纯水使得混合液的最终体积为50μL，混合后并在4℃的条件下静置存放1～2h。进一步的，所述dsDNA溶液的浓度为2μM～5μM。进一步的，所述Cy5-DNA溶液的浓度为20μM～30μM。进一步的，所述混合液中Cy5-DNA与dsDNA的摩尔浓度比值为1～25：1。进一步的，所述步骤3)DNA混合液滴加在CdSQDs/GCE表面的具体步骤如下：取10μL混合液小心地滴加到CdSQDs/GCE表面，4℃的条件下静置反应10～16h；采用的6-巯基-1-己醇的浓度为0.1mM～1mM，用量为5μL。进一步的，所述步骤4)Nb.BbvCI的剂量为0～10U；混合液滴加到传感器表面的具体步骤如下：取10μL混合液小心地滴加到传感器表面，37℃的条件下反应1.5～3.5h。进一步的，所述步骤5)透射电子显微镜对CdSQDs的表征的具体步骤如下：将10μL经过稀释的CdSQDs溶液滴加到铜网上，室温下自然晾干之后，进行透射电子显微镜检测。有益效果：本专利技术原理简单、所用材料成本较低，在相同的条件下可以准确地检测出更低含量的待测物。本专利技术主要利用OTA与适体之间的特异性识别作用和DNA行走机器人的信号放大作用。OTA夺走aptamer之后，DNAwalker能够循环多次地与电极表面的Cy5-DNA进行杂交，导致大量的Cy5-DNA被Nb.BbvCI切割进而远离电极表面，Cy5-DNA对CdSQDs所产生的光信号的猝灭作用减弱，从而引起传感器表面电化学发光信号强度的变化。OTA的加入量越多，传感器表面自由的DNAwalker越多，被切割的Cy5-DNA越多，CdSQDs/GCE的电化学发光信号就越强，以此实现OTA的定量检测。本专利技术不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，极大地降低了OTA的检测成本，具有灵敏度高、抗干扰能力强、制备简便且成本低廉的优点。附图说明图1显示了CdSQDs/GCE的制备过程；图2显示了基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的流程图；图3显示了硫化镉量子点(CdSQDs)的透射电子显微镜(TEM)图像；图4显示了电化学发光分析仪定量检测OTA的电化学发光强度变化图。A：在不同浓度的OTA作用下，得到的电化学发光强度-时间曲线；B：电化学发光强度峰信号值与OTA浓度的关系图，插图为OTA浓度的线性校准曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作更进一步的说明。实施例1：基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A(OTA)的分析方法，检测步骤是：赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA(dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(aptamer，DNAwalker)各1μL，95℃与8μL杂交缓冲溶液(10mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH7.4)水浴5分钟后冷却至室温。dsDNA和DNA探针(Cy5-DNA)以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液的制备：取上述10μL2.5μM的dsDNA溶液和5μL25μM的Cy5-DNA溶液、5μL10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液混合，然后加入超纯水使得DNA混合液的最终体积为50μL；最后将DNA混合液在4℃的条件下静置存放1h。硫化镉量子点修饰的玻碳电极(CdSQDs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后取5μL5mg/mL的CdSQDs溶液滴加到干燥后的玻碳电极表面，在4℃的温度下静置干燥3h，得到CdSQDs/GCE，如图1所示。制备电化学发光适体传感器的具体步骤：先取10μLDNA混合液小心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA即dsDNA；2)制备dsDNA和DNA探针即Cy5‑DNA以及三(2‑羧乙基)膦盐酸盐的混合液；3)将上述DNA混合液滴加在CdS QDs/GCE表面，采用6‑巯基‑1‑己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；4)制备OTA和切刻内切酶Nb.BbvCI的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；5)利用透射电子显微镜对CdS QDs/GCE进行表征。

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA行走机器人构建的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)制备赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA即dsDNA；2)制备dsDNA和DNA探针即Cy5-DNA以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液；3)将上述DNA混合液滴加在CdSQDs/GCE表面，采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性的活性结合位点之后，制得电化学发光适体传感器；4)制备OTA和切刻内切酶Nb.BbvCI的混合液，将混合液滴加到传感器表面，并利用电化学发光分析仪对反应体系进行检测；5)利用透射电子显微镜对CdSQDs/GCE进行表征。2.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤1)赭曲霉毒素A特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即aptamer和DNAwalker，在DNA杂交缓冲溶液中95～100℃水浴5min后冷却至室温，形成杂交的dsDNA。3.根据权利要求2所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述DNA杂交缓冲溶液为：10mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH7.2～7.4。4.根据权利要求1所述的电化学发光适体传感器检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述步骤2)DNA探针选取一条特定序列的荧光染料修饰的单链DNA；制备dsDNA和DNA探针即Cy5-DNA以及三(2-羧乙基)膦盐酸盐的混合液具体步骤如下：取一小离心管，依次加入dsDNA溶液、Cy5-DNA溶液和三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，随后加入超纯水使得混合液的最终体积为50μL，混合后并在4℃的条件下静置存放1～2h。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，王春蕾，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32