一种基于PMA染色的病菌定量检测方法技术

本发明专利技术一种基于PMA染色的病菌定量检测方法。所述方法包括：(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液，得到组织匀浆；(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。本方法可以用于判断植物病情，对病情进行分级；同时本发明专利技术能够检测植物组织内菌总量和活菌量，计算活菌在植物体内存活比例，提供一种用于判断病害防治方法和杀菌治疗方法的药效评价方法，为黄龙病病害防治提供一种药效及防治快速的评价方法。

A Quantitative Detection Method of Bacteria Based on PMA Staining

The invention relates to a quantitative detection method of bacteria based on PMA staining. The methods include: (1) cutting the non-soluble solid plant sample into fragments, adding phosphate buffer after grinding to obtain tissue homogenate; (2) dividing the homogenate into group A and group B, adding PMA to group A, and adding the same volume of water to group B; (3) carrying out PMA light crosslinking, DNA extraction, DNA template quantification and fluorescence quantitative PCR treatment in two groups respectively; (4) according to group A, adding PMA to group B. The CT values of group B and group B were calculated and the proportion of living bacteria in total bacteria was obtained. The method can be used to judge plant diseases and classify them; at the same time, the invention can detect the total amount of bacteria and the amount of live bacteria in plant tissues, calculate the survival ratio of live bacteria in plants, provide a method for evaluating the efficacy of disease control methods and bactericidal treatment methods, and provide a rapid evaluation method for the prevention and control of Huanglong disease.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PMA染色的病菌定量检测方法
本专利技术涉及一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，属于分析检测

技术介绍
黄龙病是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生产上危害最严重和最具破坏性的毁灭性病害。黄龙病被认为是由一种专生于柑橘韧皮部组织的细菌引起的，其传播途径包括嫁接和柑橘木虱传播。目前所有已知的柑橘品种及柑橘近缘种都受到黄龙病病菌的浸染。感染病后的植株不仅不能产生经济价值，且易感程度高的品种如脐橙、葡萄柚等会在几年内逐渐衰亡，且目前尚无黄龙病治疗康复的相关报道。因此提供一种黄龙病病菌的快速、准确、定性和定量检测，对于黄龙病的防控和研究具有重要的意义。目前针对黄龙病病菌的检测方法主要包括电镜检测、免疫学检测和PCR检测等手段。受柑橘寄主植株内黄龙病病原菌浓度低、不均匀分布及制样技术等因素限制，电镜观察检测的检出率一般在60％～70％之间，存在大量的漏检；免疫学检测特异性太强(申请号201210093995.1)，不同植株间无法混用；PCR诊断方法虽然在柑橘黄龙病检测上的应用已经实现了快速、准确、定性和定量的要求，被广泛用于黄龙病的实验室诊断；但目前PCR诊断技术是对黄龙病病菌的DNA量进行检测，由于菌死后在短期内仍有较多的DNA残留，PCR手段不能将植物体内的死菌、活菌区分出来。此外，现有技术还公开了利用PMA进行死、活菌检测的
技术实现思路
，但检测对象须为菌液或其他液体形式，无法对非可溶性的复杂固体组织中活菌的菌含量进行定量检测。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术提供一种针对非可溶性固体植物组织中病菌含量的定量检测方法。该方法为黄龙病等植物病害的早期检测提供精准的定量分析，同时也为其防治提供准确的评价手段。本专利技术的技术方案如下：一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，包括：(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液(pH＝6.5)，得到组织匀浆；(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。下面对各步骤逐一进行说明。步骤(1)中，所述非可溶性固体植物样品为植物组织，如叶片、茎秆、根系等，优选选取叶片，实际采样时，剪取叶脉中部，剪成1mm左右的碎片，备用。步骤(1)中，所述磨样处理包括：S1：对样品进行初次磨样、振荡，获得初样；其中，所述振荡的频率为20-30HZ，优选利用钢珠振荡磨样，频率为30HZ；S2：向初样中加磷酸缓冲液(pH＝6.5)，再次磨样、振荡，形成悬浊液；S3：将悬浊液过滤，得到粒径在0.25mm以下的组织匀浆；其中，悬浊液的过滤通常使用60目的纱网，去除其中的大颗粒。步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的pH值为6-7，优选为6.5。步骤(2)中，向A组匀浆中加入PMA至其浓度为5mg/l-30mg/l之间；优选浓度为10-15mg/l。步骤(3)中，所述PMA光交联处理包括：将A、B两组振荡均匀，置于0-10℃环境下依次进行暗反应、光反应；反应完成后，离心，弃上清液；洗涤，离心，弃上清液，保留沉淀；优选地，暗反应处理30min，光反应为置于650W卤钨灯下光反应15min，离心速度为12000转。步骤(3)中，所述DNA提取处理包括：向所述PMA光交联处理后的样品中加入CTAB裂解液，振荡，置于水浴锅中裂解；结束后，加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合液，摇匀，离心，取上清，向上清液中加等体积异丙醇，摇匀，冷却后，离心，弃上清液，继续加入75％乙醇，离心，取下层烘干，待变成无色透明状，加入灭菌的ddH2O，溶解；其中，所述CTAB裂解液的加入量为800ul；步骤(3)中，所述DNA模板定量处理包括：使用本领域常规的核酸定量设备对提取的DNA进行定量，将两组DNA稀释至两组DNA浓度最小公约数，更有助于提高检测结果的准确性。步骤(3)中，所述荧光定量PCR处理中，选择相应的特异性引物对植物组织内的病菌做PCR定量处理，进行活菌定量检测分析；所述病菌优选为柑橘黄龙病。步骤(4)中，A组的Ct为活菌的Ct，B组的Ct为组织中病菌总量的Ct；通过A组与B组的Ct值差值△Ct，计算活菌在总菌群中的所占比例F，F＝2-△Ct。本专利技术还提供上述检测方法在非可溶性固体植物的病菌检测中的应用；所述非可溶性固体植物不局限于柑橘品种、柑橘近缘种样品，也包括其他非可溶性固体植物；所述病菌不局限于黄龙病，还包括其他细菌性植物病害。本专利技术通过将磨样处理技术、PMA染色技术及PCR定量技术相结合，实现了对非可溶性固体活体植物组织中黄龙菌活菌及总菌的检测。所述检测方法可以用于判断植物病情，对病情进行分级；同时能够检测植物组织内总菌量和活菌量，确定活菌在植物体内的存活比例，为黄龙病病害的防治提供有效的药效评价基础。附图说明图1为实施例1所述检测方法的流程图。图2为实施例1中不同处理下的黄龙病病菌的Ct值图。图中：A1代表未加热处理+PMA处理的样本、B1代表未加热处理+未加PMA处理的样本、A2代表加热处理+PMA处理的样本、B2代表加热处理+未加PMA处理的样本。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1利用PMA染色技术测定脐橙叶片中黄龙病病菌的活菌和总菌数如图1所示，具体测定方法如下：(1)材料：选择三年生、染黄龙病的纽赫尔脐橙苗，作为样本；(2)预处理：取脐橙苗的叶片共24枚，随机平分两份，将其中一份12枚放置到95℃烘箱，加热5min灭菌处理，作为灭菌处理组；另一份12枚不作处理，作为未灭菌处理组。(3)磨样处理：将两份(灭菌处理组、未灭菌处理组)叶片采取相同的方式分别磨样处理；以未灭菌处理组为例，具体如下：i、剪取叶片的叶脉中部，剪成1mm长短叶脉碎片；ii、将碎片混匀，称量叶脉碎片的重量，将叶脉碎片以1.5g一份均分，放入2ml离心管中，加入钢珠磨样，磨样使用的振荡器频率为30hz，磨样时间为5min，获得灭菌处理组的初样；iii、向每管初样加入1ml磷酸缓冲液(pH＝6.5)，再次振荡磨样，形成组织匀浆；iv、用移液枪将各离心管中组织匀浆从离心管中取出，放到试管中混匀；再将混匀的组织匀浆平分到6个1.5ml离心管中，每个离心管1ml匀浆，按每三个一组，将组织匀浆分成A组和B组；采用上述相同的步骤对灭菌处理组叶片进行磨样处理；至此，共得到组织匀浆如下：未加热组(未灭菌处理组)A1、B1，加热处理组(灭菌处理组)A2、B2；(4)PMA光交联处理：将PMA加入A1组和A2组，匀浆至10mg/l的浓度，剩余B1和B2加入等量无菌水，振荡均匀，将A1、A2、B1、B2组置于冰上暗反应处理30min，光反应15min；反应完成后，将离心管取出，以12000转离心，弃上清液；加入600ul无菌水悬浊，再以12000转离心，弃上清液；(5)剩余沉淀的DNA提取：每个离心管中加入800μl65℃预热过得CTAB裂解液，振荡，置于65℃水浴锅中裂解50分钟，每10min摇一次；50min结束后，向离心管中加入体积比为24：1氯仿异戊醇600μl，摇匀；放入离心机中1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，其特征在于，包括：(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液，得到组织匀浆；(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。

【技术特征摘要】
1.一种基于PMA染色的病菌定量检测方法，其特征在于，包括：(1)将非可溶性固体植物样品剪成碎片，磨样处理后加入磷酸缓冲液，得到组织匀浆；(2)将匀浆分为A、B组，向A组加入PMA，同时向B组匀浆中加入相同体积的水；(3)将A、B两组分别依次进行PMA光交联处理、DNA提取、DNA模板定量、荧光定量PCR处理；(4)根据A、B组的Ct值，计算得出活病菌在总病菌中的所占比例。2.根据权利要求1所述的基于PMA染色的病菌定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磨样处理包括：S1：对样品进行初次磨样、振荡，获得初样；S2：向初样中加磷酸缓冲液，再次磨样、振荡，形成悬浊液；S3：将悬浊液过滤，得到组织匀浆。3.根据权利要求1或2所述的基于PMA染色的病菌定量检测方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH值为6-7，优选为6.5。4.根据权利要求2所述的基于PMA染色的病菌定量检测方法，其特征在于，所述振荡的频率为20-30HZ。5.根据权利要求2所述的基于PMA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晗，董宏图，王成，侯佩臣，王晓冬，宋鹏，罗斌，
申请(专利权)人：北京农业智能装备技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11