利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5‑羟甲基糠酸的方法，将乌鲁木齐奇异球菌R12接种于TGY培养基，活化和培养后，收集菌体细胞；将5‑羟甲基糠醛加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入收集的菌体细胞，在温度25～60℃下反应3～48h，得到5‑羟甲基糠酸。本发明专利技术利用的生物催化剂乌鲁木齐奇异球菌对5‑羟甲基糠醛具有高耐受性，能够催化高浓度底物选择性氧化合成目标产物，产率达89％以上。本发明专利技术方案克服了现有技术中化学催化剂环境不友好的缺点，并且具有底物浓度更高、反应效率更优异，选择性好的特点。

Catalytic synthesis of 5-hydroxymethyl furoic acid by Strange Coccus Urumqi

The invention relates to a method for synthesizing 5_hydroxymethyl furoic acid catalyzed by Mirabilis urumqi. Mirabilis Urumqi R12 is inoculated into the TGY medium, activated and cultured, and the bacterial cells are collected; 5_hydroxymethyl furfural is added into the buffer solution of pH 6.0-10.0, mixed evenly, and then added into the collected bacterial cells, and reacted for 3-48 hours at 25-60 degrees Celsius to obtain 5. Hydroxymethyl furoic acid. The biocatalyst utilized by the invention has high tolerance to 5 hydroxymethyl furfural, and can catalyze selective oxidation of high concentration substrates to synthesize target products with a yield of over 89%. The scheme overcomes the disadvantage of unfriendly environment of chemical catalyst in the prior art, and has the characteristics of higher substrate concentration, better reaction efficiency and good selectivity.

【技术实现步骤摘要】
利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法
本专利技术涉及一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，属于生物催化及化学工程领域。
技术介绍
羟甲基糠醛(HMF)是由葡萄糖或果糖脱水生成的化学物质，分子中含有一个呋喃环，一个醛基和一个羟甲基，其化学性质比较活泼，可以通过氧化、氢化和缩合等反应制备多种衍生物，是重要的精细化工原料，也被认为是最具价值和潜力替代石化工业中基础化学品的生物基平台化学品。人们对5-羟甲基糠醛的研究主要基于以下两个重要原因：一方面，生物预处理水解液中的HMF会导致许多微生物的生长抑制，并具有一定的毒性作用，从而影响后续发酵合成化学品和燃料过程的产量和效率。另一方面，由于HMF分子呋喃环上带有醛基和羟甲基等高活性官能团，可以催化氧化生成一系列呋喃类芳香化合物，例如，根据氧化的位置和氧化程度，可以分别氧化成5-羟甲基-2-呋喃甲酸(5-hydroxymethylfuroicacid，HMFCA)，2，5-呋喃二甲醛(2，5-diformylfuran，DFF)，5-甲酰基-2-呋喃甲酸(5-formylfuroicacid，FFCA)，2，5-呋喃二甲酸(2，5-furandicarboxylicacid，FDCA)，当环上醛基被还原为羟基，得到HMF的还原产物2,5-呋喃二甲醇(2,5-Furandimethanol，BHMF)。这些氧化还原衍生物都是关键的合成桥梁化合物，在农业、能源、医药、高分子等领域有着广泛应用。例如，HMFCA自身带有羧基和羟甲基，可以自身或者与其他化合物聚合成多种聚酯，同时还可以作为白介素抑制剂。目前，由HMF制备HMFCA主要有化学转化法和生物转化法。化学转化法已经取得较多进展，主要是以金属催化剂催化HMF氧化制备，然而，化学法反应需要较高温度和压力，存在产物选择性和底物耐受性差的问题；利用生物催化剂可在温和的反应条件下以HMF为底物，转化生成HMFCA，具有高产率和高选择性，同时保持高化学纯度，低副产物，但由于5-羟甲基糠醛对微生物细胞有毒害作用，因此，大部分微生物通常对HMF的底物耐受性浓度较低、且催化HMF转化速度慢。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，筛选获得一株对底物HMF具有高耐受性，并且能高效催化HMF选择性氧化合成HMFCA的乌鲁木齐奇异球菌(Deinococcuswulumuqiensis)R12，提供一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法。技术方案一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，包括如下步骤：(1)将乌鲁木齐奇异球菌R12接种于TGY培养基，活化后，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中培养48h，收集菌体细胞；(2)将5-羟甲基糠醛加入到pH6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入步骤(1)收集的菌体细胞，在温度25～60℃下反应3～48h，得到5-羟甲基糠酸。步骤(1)中，所述乌鲁木齐奇异球菌R12保藏于CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCCNo:M2019142。该菌株是从新疆核爆实验区受核辐射污染的土样中，分离筛选出的，经微生物分类鉴定，确定该菌株属于异常球菌属(Deinococcus)的新种，命名为DeinococcuswulumuqiensisR12,研究表明，该菌株对高剂量辐射和紫外线具有极强的耐受性。进一步，步骤(1)中，所述活化温度30℃，转速180-220r/min，活化时间30h。进一步，步骤(1)中，所述TGY培养基配方为：酵母膏质量浓度0.3％，蛋白胨质量浓度0.5％，葡萄糖质量浓度0.1％。进一步，步骤(1)中，培养条件为：30℃，180-220r/min。进一步，步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液中的任意一种。进一步，步骤(2)中，所述5-羟甲基糠醛在缓冲液中的浓度为100～500mM。进一步，步骤(2)中，所述菌体细胞的加入量为10～200mg/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术与现有的技术相比，具有如下的优点：1)利用乌鲁木齐奇异球菌作为催化剂，能高效、高选择性地催化HMF转化为目标产物HMFCA，并且克服了化学催化剂环境不友好的缺点。2)本专利技术利用的生物催化剂乌鲁木齐奇异球菌对HMF具有高耐受性，能够催化高浓度底物(300mM)选择性氧化合成目标产物，产率达89％以上。与已报道的生物催化工艺相比，本专利技术不仅底物浓度更高、反应效率更优异，而且选择性也更好。3)本专利技术反应过程简单，无需添加培养基(添加培养基会使反应体系更加复杂)，易控、条件温和，有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。4)乌鲁木齐奇异球菌对辐射、高温、干燥、化学试剂毒性等极端环境有明显的耐受性，因此可不受工业生产条件的限制。附图说明图1为乌鲁木齐奇异球菌R12菌落形态图；图2为实施例1中合成产物的液相色谱图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本专利技术的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。下述实施例中，使用的生物材料乌鲁木齐奇异球菌R12，是从新疆核爆实验区受核辐射污染的土样中分离筛选出的，该菌株对高剂量辐射和紫外线具有极强的耐受性，已保存于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCCNo:M2019142。实施例1一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，包括如下步骤：(1)将乌鲁木齐奇异球菌R12接种于TGY培养基(酵母0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.1％)，在30℃及200r/min的条件下活化30h(乌鲁木齐奇异球菌R12的菌落形态图见图1)，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中，30℃、200r/min下培养48h，收集菌体细胞；(2)在2.5mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.4)中加入0.25mmolHMF(100mM)，混合均匀后，按120mg/mL(按细胞湿重计)的浓度加入步骤(1)收集的菌体细胞，在25℃、850r/min下反应，利用液相色谱监控反应，4h后，液相色谱图见图2(HMFCA及HMF的保留时间分别为2.81及6.15min)，HMF转化率为58.57％，HMFCA产率为99.50％。其中，液相色谱检测的方法与条件分别为：仪器为ThermoFisherultimate3000，检测器为UV检测器；检测波长为230nm；色谱柱为SepaxGP-C18column(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为A：20mMKH2PO4；B：100％乙腈；梯度洗脱(0min:10％B；7min:24％；10min:10％B)；流速为1.0mlmin-1；柱温为25℃；进样量为5μl。实施例2将步骤(2)中反应温度改为40℃，其余与实施例1相同。反应4h后，HMF转化率为77.04％，HMFCA产率为99.49％。实施例3将步骤(2)中反应温度改为60℃，其余与实施例1相同。反应4h后，HMF转化率为47.88％，HMFCA产率为99.09％。实施例4将步骤(2)中磷酸盐缓冲液的pH7.4改为pH6.0，其余与实施例1相同。反应4h后，HMF转化率为57.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5‑羟甲基糠酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将乌鲁木齐奇异球菌R12接种于TGY培养基，活化后，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中培养48h，收集菌体细胞；(2)将5‑羟甲基糠醛加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入步骤(1)收集的菌体细胞，在温度25～60℃下反应3～48h，得到5‑羟甲基糠酸；步骤(1)中，所述乌鲁木齐奇异球菌R12保藏于CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCC No:M 2019142。

【技术特征摘要】
1.一种利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将乌鲁木齐奇异球菌R12接种于TGY培养基，活化后，按1％的接种量接入新鲜TGY培养基中培养48h，收集菌体细胞；(2)将5-羟甲基糠醛加入到pH6.0～10.0的缓冲液中，混合均匀后，加入步骤(1)收集的菌体细胞，在温度25～60℃下反应3～48h，得到5-羟甲基糠酸；步骤(1)中，所述乌鲁木齐奇异球菌R12保藏于CCTCC，保藏日为2019年3月14日，保藏编号为CCTCCNo:M2019142。2.如权利要求1所述利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化温度30℃，转速180-220r/min，活化时间30h。3.如权利要求1所述利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，张志刚，苍然，慎立群，杨光，张志东，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32