一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。本发明专利技术构建的apuA基因敲除突变株ΔapuA，可用于研究ApuA作为毒力因子影响SS2致病性的分子机制，为进一步研究SS2的致病机理奠定了基础，也可用于研制2型猪链球菌减毒活疫苗或基因工程多价疫苗。

A mutant strain of Streptococcus suis apuA gene knockout and its application

The invention belongs to the field of genetic engineering, and discloses a type 2 Streptococcus suis apuA gene knockout mutant strain and its application. The type 2 Streptococcus suis apuA gene knockout mutant strain is apuA, and the type 2 Streptococcus suis apuA gene knockout mutant strain apuA has been stored in the Chinese typical culture preservation center on January 14, 2019 at the address of the Chinese Code of Wuhan University of Bayi Road, Hongshan District, Hubei Province. The preservation number of this microorganism is CCTCC NO: M2019041. The apuA gene knockout mutant apuA constructed by the invention can be used to study the molecular mechanism of ApuA as a virulence factor affecting the pathogenicity of SS2, lay a foundation for further research on the pathogenesis of SS2, and can also be used to develop live attenuated vaccine of Streptococcus suis type 2 or genetic engineering multivalent vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用
本专利技术属于基因工程领域，尤其涉及一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：猪链球菌(Streptococcussuis，SS)是一种重要的人兽共患病原菌，分为33种血清型，其中猪链球菌2型(SS2)被认为是分布最广、致病性最强的一种血清型，可导致感染猪和人的急性出血性败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等，发病率和死亡率高，不仅给养猪业造成巨大的经济损失，也对公共卫生、食品安全和人类的生命安全构成威胁。我国于1998年和2005年在江苏和四川暴发两次大规模的猪及人感染SS2疫情，累计报告人感染SS2病例达229例，死亡52例，引起我国卫生部门对猪链球菌病的高度重视。近年来，猪链球菌病的发病率和死亡率逐年上升，各地SS分离株的耐药情况亦呈逐年加重的趋势，严重威胁人类公共卫生和生猪养殖产业。但是，目前关于SS2感染宿主并致病的分子机制仍不清楚。结合近年来SS的研究进展，目前已鉴定的毒力相关因子大体可分为以下三类：(1)胞膜锚定蛋白/分泌蛋白，如荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(Sly)等；(2)酶类，如谷氨酸脱氢酶(Gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等；(3)转录因子/调控因子，如糖代谢转录调控因子(CcpA)、丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶(STK)等。目前，很多发掘出的毒力因子都处于推测和假定的状态，缺乏进一步实验证明这些潜在毒力因子与SS2毒力的确切关系及其致病机制。在SS2毒力因子的研究过程中，国内外许多学者通过构建某一基因的敲除突变株，并与野生株比较毒力变化，来揭示该基因在SS2致病中的作用，也为新型疫苗的研发奠定了理论基础。疫苗是一种安全有效的病原菌防控手段，特别是减毒活疫苗和亚单位疫苗。减毒活疫苗以全菌体为基础，用量小、免疫原性好，而且免疫期长、使用方便，亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、便于产业化、技术成熟等优点，成为SS2新型疫苗研发的两个重要方向。SS2的ApuA是一个双功能淀粉酶，由SS2的apuA基因编码，含有6285个碱基对(bp)，有保守的α-淀粉酶和普鲁兰酶的底物结合、催化结构域，并具有保守的LPNTG基序，这是革兰氏阳性菌表面蛋白质的典型特征。在已有详细研究的同源淀粉酶中，ApuA与肺炎链球菌的SpuA、A群链球菌的PulA和无乳链球菌的SAP，分别具有58％、58％和55％的氨基酸序列同源性。SpuA已被证实是肺炎链球菌主要的毒力因子，与二型肺泡细胞糖原有高度亲和性。PulA可介导A群链球菌黏附5种人口咽腔肿瘤细胞系(牙龈、喉、舌、扁桃体和鼻)。SAP介导B群链球菌对人宫颈上皮细胞的黏附，其亚单位疫苗可有效的预防病原菌在宿主体内的定植。2010年，Ferrando等在SS2菌株Strain10中，将壮观霉素抗性基因盒插入apuA基因的3114bp处，使apuA基因的普鲁兰酶编码序列无法表达，但保留apuA基因的启动子及其α-淀粉酶编码序列。Ferrando发现，ApuA可以促进猪链球菌对猪气管上皮细胞的黏附，是假定的毒力因子。但是，目前尚无直接证据证实ApuA是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用也尚不清楚。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中很多发掘出的毒力因子都处于推测和假定的状态，缺乏进一步实验证明这些潜在毒力因子与SS2毒力的确切关系及其致病机制，不利于全面解析SS2感染宿主并致病的分子机制，也制约了新型减毒活疫苗或亚单位疫苗的研发进程。(2)ApuA作为亚单位疫苗候选蛋白，apuA基因的缺失突变株也是减毒活疫苗候选菌株，需要进一步的实验数据作为理论依据。但是，目前尚无直接证据证实ApuA是SS2的黏附素和毒力因子，其在SS2致病过程中所起的作用尚不清楚。(3)文献报道中的apuA基因只有部分片段被失活，保留了apuA基因的α-淀粉酶编码序列的功能，其实验结果无法反应全长apuA基因的功能。解决上述技术问题的难度：apuA的基因编码序列长度为6285bp，利用现有同源重组的方法，很难得到apuA基因全长编码序列的缺失突变株。解决上述技术问题的意义：本专利技术提供一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的制备方法及其应用，可从细菌基因组上使apuA基因无法转录和表达，并对apuA基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进行了分析，明确了apuA基因与SS2致病性的关系。本专利技术进一步探索研究SS2菌株的毒力因子及其在SS2与宿主相互作用中发挥的作用，有利于阐明SS2的致病机理、建立快速准确的诊断鉴定方法或开发新型保护性抗原，对进一步提高SS2预防和治疗水平具有重要的现实意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株及其应用。本专利技术是这样实现的，一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株(StreptococcussuisapuA)，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA(StreptococcussuisΔapuA)，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCCNO：M2019041。本专利技术的菌株具有如下特征：该菌属于球菌科、链球菌属，具有荚膜的革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，呈卵圆形，无鞭毛，不运动，不形成芽孢，常以链形式存在。细菌的增殖需要血清或者血液，在添加5％胎牛血清的TSA培养基上生长24h，可见透明、湿润的圆形菌落，在添加5％鲜血的TSA培养基上生长24h，可见α-溶血环。本专利技术的另一目的在于提供一种所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法包括：由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒代替后所得；apuA基因全长6285bp，选择apuA基因启动子(93bp)与apuA基因5’端(2593bp)共计2686bp的片段进行缺失获得；进一步，SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。进一步，所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法具体包括：(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp序列和apuA基因5’端下游1000bp序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm+；(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm+-下游的顺序定向连接到温敏型自杀性穿梭载体pSET4S中，得到重组自杀性穿梭质粒pSET4S-ΔapuA；(3)经测序鉴定正确后，将自杀性质粒pSET4S-ΔapuA转入SC19菌株中，筛选具有红霉素抗性的克隆，利用荧光定量PCR获得2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA。进一步，步骤(3)的具体为：1)制备2型猪链球菌SC19菌株的感受态细胞，加入pSET4S-ΔapuA质粒，混匀后进行电击，复苏后将菌液涂布在含壮观霉素(spc)的大豆胰蛋白琼脂培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCC NO：M2019041。

【技术特征摘要】
1.一种2型猪链球菌apuA基因敲除突变株，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株为ΔapuA，2型猪链球菌apuA基因敲除突变株ΔapuA，已于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，该微生物的保藏号为CCTCCNO：M2019041。2.一种如权利要求1所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法包括：由2型猪链球菌菌株SC19中的apuA基因部分片段被红霉素抗性基因盒代替后所得；apuA基因全长6285bp，选择apuA基因的启动子93bp与apuA基因的5’端2593bp共计2686bp的片段进行缺失获得。3.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，SC19是2型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000。4.如权利要求2所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，所述的2型猪链球菌apuA基因敲除突变株的构建方法具体包括：(1)以SC19菌株基因组DNA为模板，扩增apuA基因启动子上游1000bp和apuA基因5’端下游1000bp序列；以pAT18质粒为模板，扩增红霉素抗性基因盒序列erm+；(2)将步骤(1)得到的三个片段的基因序列，按上游-erm+-下游的顺序定...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭美芳，周锐，朱嘉琪，邓思敏，张丽君，
申请(专利权)人：江西省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36