用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法技术

提供了用于克隆T细胞受体(TCR)的方法、组合物、重组DNA分子和试剂盒。该方法有助于从含有抗原特异性T细胞的生物样品构建TCR表达文库，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，其中包括冷冻的肿瘤活组织检查物。用源自文库的TCR基因工程化的外周T细胞示出有效的治疗性抗肿瘤效果。该方法可以采用任何含有T细胞的样品进行，并且可以用寡克隆T细胞群体(如已经浸润肿瘤的T细胞)进行。提供了用于第一链cDNA合成、第二链cDNA合成和用于将多种不同的TCRβ链和TCRα链克隆到多种载体中的引物组合。提供了含有载体的细胞，以及用于快速克隆TCRβ链和TCRα链的试剂盒。

Compositions and Methods for Rapid Cloning of T Cell Receptors

Methods, compositions, recombinant DNA molecules and kits for cloning T cell receptors (TCR) are provided. The method is helpful to construct a TCR expression library from biological samples containing antigen-specific T cells. The biological samples include, but are not limited to, tumor biopsies, including frozen tumor biopsies. Effective therapeutic antineoplastic effects were demonstrated by using TCR genetically engineered peripheral T cells derived from the library. This method can be carried out using any sample containing T cells and using oligoclonal T cell populations, such as T cells that have infiltrated the tumors. Primer combinations for the synthesis of first-stranded and second-stranded cDNAs and for cloning various TCRbeta and TCRalpha chains into various vectors are provided. Cells containing vectors and kits for rapid cloning of TCR beta and TCR alpha chains are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2016年8月1日提交的美国临时申请第62/369,321号的优先权，通过引用将其公开内容合并于此。
本公开大体上涉及用于快速克隆和表征T细胞受体的组合物和方法。
技术介绍
肿瘤抗原特异性T细胞经由异二聚体T细胞受体(TCR)识别癌症靶标，而该异二聚体T细胞受体识别加载在癌细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)分子上的源自肿瘤抗原的肽。TCRα链和β链二者中的高度多样化序列(尤其是它们的补体决定区3(CDR3)中的序列)决定了MHC限制性和肽特异性。将自体肿瘤抗原特异性T细胞过继转移到癌症患者对于治疗癌症患者是有前景的治疗性策略。为了克服扩增大量的来自患者的自体肿瘤抗原特异性T细胞的局限性所带来的挑战，已经开发了具有肿瘤抗原特异性TCR基因的外周大量T细胞群体的基因工程。已经广泛证明了TCR基因工程化的T细胞具有与针对癌症靶标的亲本T细胞克隆可比较的抗肿瘤作用。测试TCR基因工程化T细胞的临床试验已经证明了其对于多种肿瘤类型具有可行性、安全性和治疗性效果。然而，仅开发了有限数量的治疗性抗肿瘤TCR基因，这限制了这种强有力的治疗性策略在癌症患者中的广泛应用。传统上，从在体外扩增的充分表征的肿瘤抗原特异性T细胞克隆获得肿瘤抗原特异性TCRα链和β链基因。然而，以高通量方式建立靶向各类肿瘤抗原和MHC限制性元件的肿瘤抗原特异性T细胞克隆是费力且在技术上具有挑战性。最近，单细胞方法，如单细胞PCR(G.C.Wang,P.等人，Sci.Transl.Med.4,128ra142(2012)；E.Kobayashi,等人，Nat.Med.19,1542-1546(2013)；S.Seitz,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103,12057-12062(2006)；G.Dossinger,等人，PLoSOne8,e61384(2013)；A.Han,J等人，Nat.Biotechnol.32,684-692(2014))和乳液PCR((M.A.Turchaninova,等人，Eur.J.Immunol.43,2507-2515(2013)；D.J.Munson,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA113,8272-8277(2016))已经成功确定了肿瘤抗原特异性TCR对。然而，从癌症样本中获得高质量的抗肿瘤T细胞需要收集并处理相对大量的手术样本，对于所有患者而言这可能是不可行的。可替换地，已经利用下一代测序(NGS)来确定来自肿瘤样本的成对的TCRα链和β链序列((C.Linnemann,等人，Nat.Med.19,1534-1541(2013)；A.Gros,等人，Nat.Med.22,433-438(2016)；A.Pasetto,A等人，CancerImmunol.Res.4,734-743(2016)；B.Howie,等人，Sci.Transl.Med.7,301ra131(2015))。在该方法中，获得了几乎完整的肿瘤浸润性T细胞的TCRα序列和β序列，并且基于每个样本中的匹配频率预测了TCRα链和β链基因的配对。然而，采用该方法估计TCR基因的绝对频率仍然具有挑战性，因为存在显著比例的T细胞表达两种TCRα链基因(Padovan等人，Science262,422-424(1993))。此外，在基于单细胞和基于NGS的方法中，对于许多候选对，终点结果通常是配对TCR基因序列。然后，需要多种繁琐程序(如合成TCR表达盒、表达载体中克隆和测试针对靶抗原的反应性)以确定治疗性TCR基因候选物。总而言之，快速确定肿瘤反应性TCR基因以用于个体化过继性T细胞疗法仍然存在重大挑战。因此，对于快速确定肿瘤反应性TCR基因的改进方法，存在持续和未满足的需求。本公开与此需求相关。
技术实现思路
本公开提供了用于克隆TCR的方法、组合物、重组DNA分子和试剂盒。特别地，本公开提供了从含有抗原特异性T细胞的生物样品构建TCR表达文库的新方法，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，包括冷冻的肿瘤活组织检查物。构建了TCR表达盒，并在24小时内通过无偏PCR扩增组装有TCR恒定区的TCRα链和β链可变区以在逆转录病毒质粒载体中进行克隆。通过由肿瘤抗原特异性T细胞克隆构建表达TCR的载体并且功能性评估经TCR基因转导的T细胞，成功验证了该方法。该方法适合用于肿瘤抗原特异性T细胞浸润的冷冻卵巢肿瘤样本。使源自肿瘤的TCR文库在来自健康志愿者的外周T细胞上表达，以用于通过采用MHC/肽四聚体试剂来筛选肿瘤抗原特异性TCR对。单轮筛选确定了功能性肿瘤抗原特异性TCR对。用源自文库的TCR基因工程化的外周T细胞在肿瘤异种移植模型中表现出有效的治疗性抗肿瘤作用。因此，本文提供的方法可以有效快速地提供表达肿瘤特异性TCR的病毒载体，用于以个体化方式制备治疗性抗肿瘤T细胞产物。在某些实施方式中，本公开提供了从任何含有T细胞的生物样品的T细胞TCR克隆多种TCRα链和β链可变序列的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开涉及从T细胞的寡克隆群体克隆TCRα链和β链可变序列。在某些实现方式中，T细胞的寡克隆群体包括可识别由癌细胞表达的抗原的T细胞，其中该抗原与恶性表型相关。在一种方法中，本公开包括：从T细胞(如从寡克隆T细胞群体)获得RNA，其中RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并从mRNA产生第一单链cDNA，其中该第一单链cDNA包括编码TCRα链的单链cDNA和编码TCRβ链的单链cDNA，其中采用逆转录和寡聚-dT引物来产生单链cDNA，以获得从mRNA扩增的第一链cDNA的样品。将包含从编码TCRα链和β链可变序列的mRNA扩增的第一链cDNA的样品分开，使得存在至少两种含有第一链cDNA的样品。在一个实施方式中，将从mRNA扩增的第一链cDNA样品分为第一样品和第二样品(其可以简单地包括：从第一链cDNA合成反应中取出等分试样，并将其置于单独的容器中)，并且进行第一样品的PCR反应和第二样品的PCR反应以获得双链cDNA。在一个实施方式中，在第一样品中，进行第二链cDNA合成以获得编码TCRβ链的双链cDNA。这通过采用表1中称为HTTCR#C-1至HTTCR#C-45的全部或部分引物(即，采用所有45种引物或部分这些引物)来进行。在第二样品中，采用表1中HTTCR#F-1至HTTCR#F-49的全部或部分引物(即，采用所有49种引物或部分这些引物)来进行第二链cDNA合成，以获得编码TCRα链的双链cDNA。在获得可以包含编码多种不同TCRα链和β链可变序列的序列的双链cDNA之后，将第一样品和第二样品暴露于核酸外切酶中一段时期，其足以降解未合并到扩增子中的引物，并且降解可能存在的单链cDNA。然后，通过例如使用热处理使核酸外切酶失活。在核酸外切酶处理(如果进行的话)之后，该方法包括采用标签特异性引物HTTCR#A-ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQIDNO：1)和引物HTTCR#B-CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从寡克隆T细胞群体的T细胞受体(TCR)克隆多种TCRα链和β链可变序列的方法，所述方法包括：1)从所述寡克隆T细胞群体获得RNA，其中所述RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并且从所述mRNA产生第一单链cDNA，其中所述第一单链cDNA包括编码所述TCRα链的单链cDNA和编码所述TCRβ链的单链cDNA，其中采用寡聚dT引物通过逆转录产生所述单链cDNA以获得从所述mRNA扩增的第一链cDNA的样品；2)将1)中的所述样品分成第一样品和第二样品并且进行聚合酶链式反应(PCR)，所述反应包括：采用以下所有引物在所述第一样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRβ链的双链cDNA扩增子，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.01 US 62/369,3211.一种从寡克隆T细胞群体的T细胞受体(TCR)克隆多种TCRα链和β链可变序列的方法，所述方法包括：1)从所述寡克隆T细胞群体获得RNA，其中所述RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并且从所述mRNA产生第一单链cDNA，其中所述第一单链cDNA包括编码所述TCRα链的单链cDNA和编码所述TCRβ链的单链cDNA，其中采用寡聚dT引物通过逆转录产生所述单链cDNA以获得从所述mRNA扩增的第一链cDNA的样品；2)将1)中的所述样品分成第一样品和第二样品并且进行聚合酶链式反应(PCR)，所述反应包括：采用以下所有引物在所述第一样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRβ链的双链cDNA扩增子，采用以下所有引物在所述第二样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRα链的双链cDNA扩增子，3)将所述第一样品和所述第二样品与核酸外切酶孵育一段时期，以足以降解未合并到所述扩增子的引物和可能存在的单链cDNA，随后利用热处理使所述核酸外切酶失活；4)采用标签特异性引物HTTCR#A-ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQIDNO：1)和引物HTTCR#B-CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SEQIDNO：2)在所述第一样品中对编码TCRβ链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRβ链的扩增子，其中所述编码TCRβ链的扩增子还包含限制性核酸内切酶识别位点、Kozak序列和翻译起始ATG序列；采用标签特异性引物HTTCR#DGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQIDNO：48)和HT-TCR#EAGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQIDNO：49)在所述第二样品中对编码TCRα链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRα链的扩增子，其中所述包含TCRα链的扩增子还包含P2A序列和起始ATG序列；和5)将4)中的所述编码TCRβ链的扩增子和所述编码TCRα链的扩增子组装成DNA载体，以提供多种DNA载体，每种DNA载体包含编码仅一种TCRβ链和仅一种TCRα链的DNA区段，其中所述载体包含编码TCRβ链的区段和编码TCRα链的区段之间的Cβ-2A融合区段，从而提供多种DNA载体，所述多种DNA载体中的每种载体仅编码所述寡克隆T细胞群体的所述TCR的单种TCRβ链和单种TCRα链。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡克隆T细胞群体获得自癌症肿瘤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌、骨髓瘤、肉瘤，由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的肿瘤，和/或其中所述肿瘤包括表达包括以下至少一种的免疫原性肿瘤抗原的癌细胞：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPVE6和E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突变Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、间皮素、叶酸受体α和患者特异性新抗原。4.根据权利要求2所述的方法，其中5)中的所述DNA载体能够在淋巴细胞中表达所述TCRα链和所述TCRβ链，使得所述淋巴细胞表现出针对由所述癌症肿瘤表达的抗原的抗原特异性。5.根据权利要求2所述的方法，包括向淋巴细胞中引入至少一种5)中的DNA载体，并且允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，使得所述淋巴细胞表达包含所述TCRβ链和所述TCRα链的功能性TCR。6.根据权利要求2所述的方法，包括向淋巴细胞引入至少一种5)中的DNA载体，允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，并且随后将包含所述至少一种DNA载体的所述淋巴细胞暴露至与所述癌症肿瘤具有相同类型癌症的癌细胞，并且确定所述淋巴细胞是否表现出针对由所述癌细胞表达的抗原的抗原特异性。...

【专利技术属性】
技术研发人员：坤勒·奥顿斯，理查德·科亚，塔克马萨·特苏基，
申请(专利权)人：健康研究公司，
类型：发明
国别省市：美国,US