产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法技术

本发明专利技术的课题在于提供能够高效地生产芽孢的新培养方法，提供一种产芽孢细菌的培养方法，其将抑制芽孢形成的物质添加到培养基后培养产芽孢细菌，其特征在于，所述培养基的碳的含量为9.1g/L以上，优选提供还包括在所述培养基中添加促芽孢形成物质的工序的产芽孢细菌的培养方法。

Culture methods of sporogenous bacteria and manufacturing methods of useful substances

The subject of the present invention is to provide a new culture method capable of producing spores efficiently, and to provide a culture method of spore-producing bacteria by adding a substance inhibiting spore formation to the culture medium to cultivate spore-producing bacteria. The characteristics of the method are as follows: the carbon content of the culture medium is more than 9.1g/L, and the process of adding spore-promoting substances to the culture medium is preferably provided. Culture methods of sporogenous bacteria.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法
本专利技术涉及产芽孢细菌的培养方法。
技术介绍
芽孢杆菌属等产芽孢细菌被用于酶、有用物质的生产、发酵食品的生产、有机物的分解、整肠剂、微生物农药、微生物肥料等各种领域。作为整肠剂、微生物农药、微生物肥料利用产芽孢细菌时，需要将活着的菌体作为有效成分加入到产品中，但一般而言是利用耐久力优异的芽孢状态的菌体。因此，正在寻求更高效地生产芽孢的方法。产芽孢细菌通过被放置到适于增殖的环境而增殖，通过被放置到适于芽孢形成的环境而在营养细胞中形成芽孢。芽孢的数目不可能超过原本的营养细胞的数目，因此对于芽孢的生产率提高而言，存在以下的至少2个方面，即，营养细胞的培养生产率的提高、和自营养细胞的芽孢形成率的提高。适于增殖的环境是指，即对于该菌株而言，增殖所需的营养成分充分，且水分量、浸透压、温度、pH、氧浓度等处于能够增殖的范围内。另外，在酶、有用物质的生产中，正在寻求更高效地生产目标代谢物的方法。对于酶、有用物质的生产率提高而言，存在以下的至少2个方面，即，向高生产目标物质的代谢状态的诱导、和长时间维持该状态。以往，营养细胞的培养生产率提高、高生产代谢物的代谢状态的维持，是通过上述的各种条件的最适化、特别是培养基组成的改良和其浓度的提高来达成。关于芽孢杆菌属细菌的高生产芽孢的技术，例如如非专利文献1～3中所例示地存在大量报道，但均使用了改良培养基的组成、浓度的方法。它们中的非专利文献3是报道了最高生产率的一篇，但根据该文献，每1L培养基中使用的糖的量为约100g/L(包括补料的量)，使用了包含非常高浓度的糖的培养基。但是，若将浓度提高到更高，则培养装置的氧供给能力赶不上氧需求量的增大、或者营养成分在培养基中长期残留，因此产生芽孢形成率降低、或者培养所需要的时间变得长期化等弊病。另外，糖等营养成分本身为高浓度时，存在表现出增殖抑制作用的可能性。此外，培养中的营养细胞浓度提高时，因检测自身浓度并切换代谢的机理“群体效应”而启动芽孢形成诱导，因此会产生无论使营养成分变得多浓，营养细胞也不会增殖到一定水平以上的现象。如上所示，使添加到培养基中的营养成分的浓度变浓来提高培养生产率的以往方法存在极限。另一方面，专利文献1中公开了如下的方法，即，通过在营养细胞的增殖后使溶存氧浓度降低来进行芽孢形成的方法。另外，专利文献2中公开了如下的方法，即，通过在将碳源消耗殆尽后继续长时间的培养来形成芽孢的方法。另外，专利文献3中公开了如下的方法，即，通过规定培养液的磷酸盐浓度的范围、以及作为培养条件的氧供给量、搅拌速度的范围来生产芽孢的方法。但是，这些技术均是赋予适于营养细胞形成芽孢时的条件的技术，而不是有助于对于从根本上提高芽孢的生产率而言必须的“营养细胞的高浓度增殖”的技术。另外，非专利文献4中示出，通过使用使增殖抑制浓度为更低浓度的抗生素可以抑制芽孢杆菌属细菌培养中的芽孢化、通过向其中加入德夸菌素可消除芽孢化的抑制效果。但是非专利文献4中使用的低浓度的培养基(葡萄糖浓度1％、培养基中的碳含量4.0g/L)中显示出，所形成的芽孢的浓度依赖于所添加的抗生素的浓度地降低，从而不能说是能够有助于芽孢的高生产的技术。关于利用芽孢杆菌属细菌的有用物质生产技术，例如专利文献4～5所例示地报道了很多，但均是记载了改良培养基组成、培养条件的方法。但是如前所述，由于氧需求量的增大、营养成分所致的增殖抑制、群体效应所致的芽孢形成诱导等，使培养基成分的浓度变浓来提高培养生产率的方法存在极限。另外，该专利文献中记载了通过转化体、突变来获得高生产目标代谢物的菌株的方法，但由于改变了野生型菌株的遗传性状，因此存在其他有用的性质丧失、或变弱的可能性。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2007-236286号公报专利文献2：日本特开2000-217567号公报专利文献3：日本特开2007-195542号公报专利文献4：日本专利第3635638号专利文献5：日本专利第4338080号非专利文献非专利文献1：Biotechnologyprogress2005，21，4，1026-1031非专利文献2：CurrMicrobiol2013，66，279-285非专利文献3：AdvancesinMicrobiology2014，4，444-454非专利文献4：JournalofGeneralMicrobiology1983，129，3709-3720
技术实现思路
专利技术要解决的课题如上所述，通过提高培养基浓度来使产芽孢细菌的芽孢生产率、代谢物等有用物质的生产率提高的以往方法存在极限，本专利技术的课题在于提供通过利用新的途径使培养中的营养细胞增殖效率提高，由此能够高效地生产芽孢、代谢物等有用物质的新型培养方法。解决课题的方法本专利技术人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过使用以高浓度包含碳源的培养基，在抑制芽孢形成的物质的存在下使营养细胞增殖，然后诱导芽孢形成，由此与未添加抑制芽孢形成的物质的情况相比，大幅提高了芽孢、代谢物等有用物质的生产率，从而完成了本专利技术。本专利技术如下所示。[1]一种产芽孢细菌的培养方法，其特征在于，包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳含量为9.1g/L以上。[2]根据[1]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为酶抑制剂。[3]根据[1]或[2]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为选自林可霉素、红霉素、利福平、氯霉素、链霉素、咖啡因、咖啡酸、放线菌素、夫西地酸、脂霉素、嘌呤霉素、壮观霉素、四环素、硫链丝菌素中的一种以上。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为对所述产芽孢细菌抑制增殖的浓度以下。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为15ppm以下。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其包括在所述培养基添加促芽孢形成物质的工序。[7]根据[6]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，从培养开始起5小时～70小时后向培养基中添加所述促芽孢形成物质。[8]根据[6]或[7]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为核酸碱基类似物、有机酸、氨基酸、铵化合物、硝酸化合物、亚硝酸化合物或矿物质。[9]根据[6]～[8]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为选自德夸菌素、咪唑立宾、麦考酚、6-氮尿嘧啶、乳酸及其盐、乙酸及其盐、丁酸及其盐、锰、铵、钙、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、乳酸铵、乙酸铵中的一种以上。[10]根据[6]～[9]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质以10ppm～10，000ppm的浓度被添加到培养基中。[11]根据[1]～[10]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述产芽孢细菌为芽孢杆菌属细菌。[12]根据[11]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，芽孢杆菌属细菌选自枯草芽孢杆菌(Bac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产芽孢细菌的培养方法，其特征在于，包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳源的含量为9.1g/L以上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.07 JP 2016-1994291.一种产芽孢细菌的培养方法，其特征在于，包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳源的含量为9.1g/L以上。2.根据权利要求1所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为酶抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为选自林可霉素、红霉素、利福平、氯霉素、链霉素、咖啡因、咖啡酸、放线菌素、夫西地酸、脂霉素、嘌呤霉素、壮观霉素、四环素、硫链丝菌素中的一种以上。4.根据权利要求1～3中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为对所述产芽孢细菌抑制增殖的浓度以下。5.根据权利要求1～4中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为15ppm以下。6.根据权利要求1～5中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其包括在所述培养基添加促芽孢形成物质的工序。7.根据权利要求6所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，从培养开始起5小时～70小时后向培养基中添加所述促芽孢形成物质。8.根据权利要求6或7所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为核酸碱基类似物、有机酸、氨基酸、铵化合物、硝酸化合物、亚硝酸化合物或矿物质。9.根据权利要求6～8中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为选自德夸菌素、咪唑立宾、麦考酚、6-氮尿嘧啶、乳酸及其盐、乙酸及其盐、丁酸及其盐、锰、铵、钙、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、乳酸铵、乙酸铵中的一种以上。10.根据权利要求6～9中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质以10ppm～10,000ppm的浓度被添加到培养基中。11.根据权利要求1～10中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述产芽孢细菌为芽孢杆菌属细菌。12.根据权利要求11所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，芽孢杆菌属细菌为选自枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、短小芽孢杆菌Bacilluspumilus、单纯芽孢杆菌Bacillussimplex、迟缓芽孢杆菌Bacilluslentus、侧孢芽孢杆菌Bacillusl...

【专利技术属性】
技术研发人员：森下康行，
申请(专利权)人：出光兴产株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP