一种脂肽的高产菌株及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种脂肽的高产菌株及其制备方法和用途，涉及微生物诱变育种及发酵工程领域。保藏编号为CCTCC NO:M 2018747，保藏日期：2018年11月05日；建议的分类命名为：Bacillus subtilis M45枯草芽孢杆菌M45。本发明专利技术通过ARTP诱变，进行血平板初筛，摇瓶复筛得到一株脂肽surfactin产量达到0.99g/L的菌株，相比较出发菌株提高35％以上，进行传代稳定性试验，菌株传代稳定性好。

A Lipopeptide-Producing Strain and Its Preparation Method and Application

The invention discloses a lipopeptide-producing strain, a preparation method and application thereof, and relates to the field of microbial mutation breeding and fermentation engineering. Preservation No. CCTCC NO: M 2018747, Preservation Date: November 05, 2018; Suggested Classification: Bacillus subtilis M45 Bacillus subtilis M45. The method of ARTP mutagenesis, blood plate screening and shaking flask screening obtains a strain with surfactin production of lipopeptide reaching 0.99g/L, which is 35% higher than the original strain, and carries out passage stability test, and the strain has good passage stability.

【技术实现步骤摘要】
一种脂肽的高产菌株及其制备方法和用途
本专利技术涉及微生物诱变育种及发酵工程领域。尤其涉及一株通过常压室温等离子体诱变获得的可用于液态发酵生产脂肽的枯草芽孢杆菌新菌株。
技术介绍
脂肽是由革兰氏阳性芽孢杆菌通过非核糖体合成途径产生的抗菌次级代谢产物，具有抗菌作用(图2所示为脂肽surfactin结构式)。1945年，Johnson等报道枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产生抗菌物质。1968年Arima等首次发现枯草芽孢杆菌能够产生脂肽Surfactin，近年来，进一步的研究表明，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusnatto)等为代表的芽孢杆菌也能产生脂肽。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素(surfactin)、芬荠素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)和杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。其中Surfactin具有很强的表面活性、抗细菌、抗病毒、抗支原体、抗肿瘤及溶纤作用的功效，在农业、医药、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。然而较低的产量和较高的生产成本限制了抗菌脂肽的工业化生产及应用。为了提高我国脂肽产品的国际竞争力和市场占有率，高质量、低成本的脂肽生产技术是目前急需解决的重要课题。微生物与酿造工业、食品工业及生物制品工业等的关系非常密切，其菌种的优良与否直接关系到多种工业化产品的好坏，微生物菌种的自然突变率很低，单纯依赖自然突变选育好的菌株远不能满足人们的需求，所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。脂肽产生菌株为芽孢杆菌为主，由于脂肽野生菌合成能力均不强，因此如何提高脂肽产生菌合成能力、选育高产菌株，提高其发酵水平，是实现脂肽工业化生产的必要前提。别小妹等人以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisfmbJ224为出发菌株，先后采用氯化锂(LiCl)、亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)和链霉素(streptomycin)进行复合诱变，得到1株高产抗菌脂肽菌株LN2-3，其surfactin产量达到239.2mg/L；闫冬等人采用原生质体融合的方法选育出抗菌脂肽高产菌株，最终以HPLC方法检测得到surfactin产量为0.274g/L。ZHU等人通过诱变后微孔板筛选的方式最终获得1株surfactin产量为0.473g/L的枯草芽孢杆菌。ARTP(常压室温等离子体)是一种新兴的诱变系统，在室温条件下使用氦气即可操作，其操作方法简单易行、诱变条件温和、射流温度低、不需要在真空的装置中进行，并且产生的等离子体十分均匀，成本也不高。其作用原理是微生物受到活性粒子的作用，活性粒子通过ARTP诱变系统中等离子体发射，能够穿破细胞壁与细胞膜，导致基因发生损伤，从而引起微生物基因序列发生变化，代谢网络也会随之改变，致使突变。该育种装置操作简单，在一定的电源功率、工作气流量、等离子体发射源与样品之间距离的条件下，诱变主要的可变操作参数是处理时间。通过对细菌、酵母、真菌、微藻等40余种微生物进行ARTP诱变育种技术诱变研究发现，此种方法诱变速度快、突变率高，并且获得的突变菌株都具有良好的遗传稳定。目前，应用常压室温等离子体对芽孢杆菌菌株进行诱变产生脂肽surfactin的相关报道较少。
技术实现思路
：本专利技术旨在提供一种Bacillussubtilis诱变菌株。本专利技术的另一个目的是提供上述诱变菌株的制备方法。本专利技术的再一个目的是提供上述诱变菌株的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种脂肽的高产菌株Bacillussubtilis诱变菌株:BacillussubtilisM45枯草芽孢杆菌M45，保藏编号为CCTCCNO:M2018747。保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏日期：2018年11月05日；建议的分类命名为：BacillussubtilisM45枯草芽孢杆菌M45。在本专利技术的第二方面，提供了一种如上所述的本专利技术提供的诱变菌株的制备方法，所诉的方法具体包括步骤：(1)出发菌的活化：将BacillussubtilisCICC1072于新鲜LB固体培养基中划线，于30-37℃下培养18-36h，接单菌落至新鲜LB液体培养基中，30-37℃下培养16-24h；(2)ARTP诱变：用无菌生理盐水洗涤活化后的菌体后重悬菌体，并适当稀释菌体浓度至106～108个/ml，和20％甘油1:1混合后取20ul均匀涂于无菌载片上，置于处理源下2mm，开始诱变处理；(3)突变菌株后培养和筛选：将诱变后的菌液适当稀释菌体浓度至102～104个/ml，均匀涂布于新鲜LB固体培养基(含有羊血)上培养72h，观察溶血圈大小，溶血圈和菌落直径比值较大的菌株可能为高产脂肽surfactin突变株，对初筛菌株进LB固体培养基中划线培养并保存后，进行摇瓶发酵复筛验证；(4)高产突变株遗传稳定性的验证：将摇瓶验证获得的高产突变株，连续传代10次，发酵测脂肽surfactin产量是否稳定。步骤(2)中诱变处理的参数设置为气流量10～16slm、射频功率120～140W、时间20～60s。步骤(3)中所用的LB固体培养基中羊血含量为5％-10％。步骤(3)中摇瓶发酵验证所用的种子培养基为LB液体培养基，30-37℃下培养16-24h后，按4-10％的接种量接种于摇瓶发酵培养基中。摇瓶发酵培养基成分为：10-50g/L葡萄糖，50-100mM/LNH4NO3、30-50mMKH2PO4、40-60mM/LNa2HPO4，金属元素(0.8-1.2mM/LMgSO4、4-10uM/LFe2SO4、7-14uM/LCaCl2、4-10uM/LNa2EDTA)，用0.1MHCl或者NaOH调PH至7-8。装液量100ml/250ml，发酵温度为30-37℃，转速160-200r/min，发酵培养时间为72-96h。在本专利技术的第三方面，提供了一种如上所述的本专利技术提供的诱变菌株的用途，用于制备脂肽surfactin，按照下述步骤进行：(1)出发菌的活化：将BacillussubtilisCICC1072于新鲜LB固体培养基中划线，于25-37℃下培养18-36h，接单菌落至新鲜LB液体培养基中，30-37℃下培养16-24h作为种子液；(2)将种子液按以体积比4-10％的接种量接种于摇瓶发酵培养基中；初始PH7-8，121℃灭菌20min。装液量100ml/250ml，发酵温度为30-37℃，转速160-200r/min，发酵培养时间为72-96h；发酵液中含有脂肽surfactin。其中所述的新鲜LB液体培养基组成如下：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉5g/L，用1MNaOH调节PH至7.0。摇瓶发酵培养基成分为：10-50g/L葡萄糖，50-100mM/LNH4NO3、30-50mMKH2PO4、40-60mM/LNa2HPO4，金属元素(0.8-1.2mM/LMgSO4、4-10uM/LFe2SO4、7-14uM/LCaCl2、4-10uM/LNa2ED本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肽的高产菌株，保藏编号为CCTCC NO:M 2018747，建议的分类命名为：Bacillus subtilis M45枯草芽孢杆菌M45。

【技术特征摘要】
1.一种脂肽的高产菌株，保藏编号为CCTCCNO:M2018747，建议的分类命名为：BacillussubtilisM45枯草芽孢杆菌M45。2.权利要求1所述的一种脂肽的高产菌株的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)出发菌的活化：将BacillussubtilisCICC1072于新鲜LB固体培养基中划线，于30-37℃下培养18-36h，接单菌落至新鲜LB液体培养基中，30-37℃下培养16-24h；(2)ARTP诱变：用无菌生理盐水洗涤活化后的菌体后重悬菌体，并适当稀释菌体浓度至106～108个/ml，和20％甘油1:1混合后取20ul均匀涂于无菌载片上，置于处理源下2mm，开始诱变处理；(3)突变菌株后培养和筛选：将诱变后的菌液适当稀释菌体浓度至102～104个/ml，均匀涂布于新鲜LB固体培养基(含有羊血)上培养72h，观察溶血圈大小，溶血圈和菌落直径比值较大的菌株可能为高产脂肽surfactin突变株，对初筛菌株进LB固体培养基中划线培养并保存后，进行摇瓶发酵复筛验证；(4)高产突变株遗传稳定性的验证：将摇瓶验证获得的高产突变株，连续传代10次，发酵测脂肽surfactin产量是否稳定。3.根据权利要求2所述的一种脂肽的高产菌株的制备方法，其特征在于步骤(2)中诱变处理的参数设置为气流量10～16slm、射频功率120～140W、时间20～60s。4.根据权利要求2所述的一种脂肽的高产菌株的制备方法，其特征在于步骤(3)中所用的LB固体培养基中羊血含量为5％-10％。5.根据权利要求2所述的一种脂肽的高产菌株的制备方法，其特征在于步骤(3)中摇瓶发酵验证所用的种子培养基为LB液体培养基，30-37℃下培养16...

【专利技术属性】
技术研发人员：何荣海，汤颖秀，侯小珊，马海乐，任晓锋，代春华，邢政，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32